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        應(yīng)用EST-ILPs分子標(biāo)記技術(shù)快速鑒定菟絲子屬種子

        2012-09-28 01:44:06郭瓊霞黃可輝
        植物保護(hù) 2012年6期
        關(guān)鍵詞:內(nèi)含子凝膠電泳菟絲子

        郭瓊霞, 莊 蓉,2, 黃 振, 黃可輝,2*

        (1.福建出入境檢驗(yàn)檢疫局,福州 350001;2.福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,福州 350002)

        近年來,分子標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜構(gòu)建、基因克隆、基因定位、遺傳多樣性分析、基因組比較、標(biāo)記輔助育種等方面的研究[1-3]。由于EST來源于編碼區(qū),內(nèi)含子位置通常較為保守;而不同種或地理亞種間的內(nèi)含子長度又存在差異,故用它建立的ILPs分子標(biāo)記在種間鑒定上具有優(yōu)越性。采用ILPs(intron length polymorphisms)分子標(biāo)記在菟絲子屬的分類鑒定上國內(nèi)外均未見報(bào)道。因此本研究利用旋花科(Convolvulaceae)番薯屬(Ipomoea)的EST(expressed sequence tags,Tags,表達(dá)序列標(biāo)簽)序列,通過網(wǎng)站(http:∥ibi.zju.edu.cn/pgl/pip/index.html)查找內(nèi)含子和外顯子,然后根據(jù)網(wǎng)站自動(dòng)設(shè)計(jì)的引物,再對(duì)9個(gè)菟絲子的樣品進(jìn)行引物的篩選,尋找種間特異性條帶從而達(dá)到分類鑒定的目的。

        1 材料與方法

        1.1 供試材料

        本試驗(yàn)選用菟絲子屬(Cuscuta)5個(gè)近似種(含不同的地理型)的種子作為研究材料。各個(gè)種的種子材料來源詳見表1。

        表1 材料來源

        1.2 總DNA的提取與凝膠電泳檢測

        1.2.1 菟絲子總DNA的提取

        選取菟絲子的種子為材料,采用SDS法提取總 DNA[4]。

        1.2.2 凝膠電泳檢測

        采用高必達(dá)等[5]設(shè)計(jì)的一對(duì)能檢測ITS序列的特異 性 引 物:A1(5′-TCGTAACAAGGTTTCCGTAG-3′)與 A2(5′-AGGAGGCCAGGATCTATT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為:25μL(10×PCR buffer,25mmol/L MgCl2,10mmol/L dNTP,5 U/μL Taq DNA 聚合酶,10μmol/L 引物,模板DNA約為100ng/μL)。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃5min;94℃1min,55℃1min,72℃1min,35個(gè)循環(huán);72℃7min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳分離,檢測400~500bp左右的擴(kuò)增片段。從而根據(jù)電泳圖上此擴(kuò)增片段的有無判斷是否提取出DNA。

        1.3 ILPs標(biāo)記的獲得和ILPs-PCR

        ILPs標(biāo)記是由浙江大學(xué)汪旭升、趙向前等根據(jù)已公布全基因組序列開發(fā)的一種內(nèi)含子長度多態(tài)性標(biāo)記[6]。從網(wǎng)站(http:∥ibi.zju.edu.cn/pgl/pip/index.html)上公布的ILPs標(biāo)記中選擇引物。選取旋花科番薯屬已經(jīng)設(shè)計(jì)好的引物10對(duì)(如表2所示),對(duì)菟絲子樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增,進(jìn)而選擇特異性片段。

        ILPs-PCR反應(yīng)體系總體積為20μL,其中含100ng模 板 DNA;上、下 游 引 物 各 0.5μmol/L;200μmol/L dNTP;1.5mmoL/L MgCl2;1UTaq DNA聚合酶;2μL 10×PCR反應(yīng)緩沖液。PCR擴(kuò)增程序:94℃ 5min;94 ℃ 46s,52.5 ℃ 45s,72 ℃1min,35個(gè)循環(huán);72℃10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳分離。對(duì)于擴(kuò)增產(chǎn)物非特異性條帶多的引物進(jìn)一步優(yōu)化起始退火溫度,調(diào)整范圍為50~58℃。每對(duì)引物組合至少重復(fù)2次以確保擴(kuò)增結(jié)果的可靠性。擴(kuò)增產(chǎn)物上樣于6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠,320V電泳1h45min。參照許紹斌等[7]的方法進(jìn)行銀染。

        表2 試驗(yàn)所用的引物

        2 結(jié)果與分析

        2.1 DNA凝膠電泳的檢測

        試驗(yàn)結(jié)果表明,采用SDS法提取菟絲子屬5個(gè)近似種(含不同的地理型)種子的總DNA,經(jīng)過凝膠電泳,其顯示在400~500bp得到一條明亮的特異條帶(如圖1所示)。從而證明所提取的菟絲子種子DNA有效,最后將已提取的DNA保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

        圖1 利用引物A1和A2的rDNA-ITS PCR擴(kuò)增圖譜

        2.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測

        因?yàn)橥嘶饻囟仁怯绊慞CR擴(kuò)增結(jié)果的重要因素,所以對(duì)試驗(yàn)條件進(jìn)行調(diào)整與優(yōu)化,經(jīng)試驗(yàn)得出結(jié)果:退火溫度為52.5℃可獲得滿意的分型效果。因此設(shè)定PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃5min;94℃46s,52.5℃45s,72℃1min,35個(gè)循環(huán);72℃10min;于4℃保存。

        根據(jù)引物IP9-1和IP9-2的聚丙烯酰胺凝膠電泳所檢測的結(jié)果(如圖2)所示,不同種的菟絲子呈現(xiàn)多態(tài)性的帶型。

        圖2 IP9-1和IP9-2引物在材料1~9中的擴(kuò)增產(chǎn)物(6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳)

        利用引物IP9-1和IP9-2擴(kuò)增的試驗(yàn)結(jié)果顯示:菟絲子屬5個(gè)近似種(含不同的地理型)9個(gè)種子樣品之間的內(nèi)含子長度表現(xiàn)為5種基因型AB、A、ABC、BD、ABD。三明日本菟絲子與苜蓿菟絲子內(nèi)含子長度的基因型均為AB;霞浦日本菟絲子內(nèi)含子長度基因型為A;恩氏菟絲子內(nèi)含子長度的基因型為ABC;南方菟絲子內(nèi)含子長度基因型為BD;福州馬尾、霞浦、福州鼓樓、新疆這4個(gè)地理型的田野菟絲子內(nèi)含子長度的基因型都是ABD。從圖2可以看出恩氏菟絲子在250bp左右具有一條特異性條帶,使其可以與其他的菟絲子區(qū)分開。南方菟絲子與田野菟絲子在內(nèi)含子長度的基因型上也具有差異;因此可以通過內(nèi)含子基因型的條帶多態(tài)性將田野菟絲子與南方菟絲子區(qū)分開。

        用引物IP4-1和IP4-2擴(kuò)增的結(jié)果(如圖3)顯示,菟絲子屬9個(gè)樣品之間的內(nèi)含子表現(xiàn)為4種基因型EFG、EF、EG、E。三明日本菟絲子內(nèi)含子長度的基因型為EFG;霞浦日本菟絲子內(nèi)含子長度基因型為EF;恩氏菟絲子內(nèi)含子長度基因型為EG;南方菟絲子、田野菟絲子、苜蓿菟絲子擴(kuò)增結(jié)果相同,基因型均為E。從圖3可以得出以下結(jié)果:兩種地理型的日本菟絲子在240bp左右具有一條特征條帶,使其可以與其他種的菟絲子區(qū)分開;苜蓿菟絲子與日本菟絲子在內(nèi)含子基因型上具有差異,可以通過條帶多態(tài)性將兩者區(qū)分開。從圖3還可以看出,不同地理型的日本菟絲子在基因型上也有所不同,三明日本菟絲子在175bp處有一條帶,但是霞浦日本菟絲子在175bp處卻沒有此條帶。

        圖3 IP4-1和IP4-2引物在材料1~9中的擴(kuò)增產(chǎn)物(6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳)

        通過圖4、圖5電泳結(jié)果的多態(tài)性綜合分析可以將本試驗(yàn)所選取的菟絲子5個(gè)近似種逐一鑒別開。

        2.3 聚類分析以及分子系統(tǒng)樹

        根據(jù)選擇的10對(duì)引物(如表2)擴(kuò)增出的穩(wěn)定條帶,利用平均連鎖聚類方式(UPGMA)軟件進(jìn)行聚類分析,生成9個(gè)供試材料的親緣關(guān)系樹狀圖(如圖6)。

        圖6 根據(jù)菟絲子近似種的ILPs分子標(biāo)記構(gòu)建的種間親緣關(guān)系圖

        從圖6可以看出:田野菟絲子、苜蓿菟絲子、南方菟絲子的親緣關(guān)系比較接近;這3種與日本菟絲子、恩氏菟絲子之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

        3 討論

        本研究對(duì)菟絲子的5個(gè)近似種的內(nèi)含子長度多態(tài)性進(jìn)行了ILPs-PCR分析。從本試驗(yàn)結(jié)果看出,a條帶可作為恩氏菟絲子的特異性條帶(如圖2示);d條帶可作為日本菟絲子特異性條帶(如圖3示)。利用ILPs分子標(biāo)記檢測菟絲子近似種是菟絲子種間鑒定的新途徑。隨著ILPs分子標(biāo)記檢測的深入研究與發(fā)展,該技術(shù)將為我國口岸雜草檢疫鑒定提供一種快速、準(zhǔn)確的檢測方法,同時(shí)也為雜草檢疫科學(xué)理論的發(fā)展奠定良好的基礎(chǔ)。

        通過本研究結(jié)果可知,不同地理型的日本菟絲子在內(nèi)含子多態(tài)性的基因型上具有差異。因此可對(duì)不同地理區(qū)域的同種菟絲子進(jìn)行進(jìn)一步的比較研究,從而完善菟絲子分類鑒定的依據(jù)。還可以進(jìn)一步從網(wǎng)站(http:∥ibi.zju.edu.cn/pgl/pip/index.html)上公布的ILPs標(biāo)記中選擇引物進(jìn)行篩選,進(jìn)而選擇菟絲子種間特異性片段,完善并實(shí)現(xiàn)菟絲子種間的快速檢驗(yàn)檢測。

        [1] 吳海濱,朱汝財(cái),李迪.一個(gè)內(nèi)含子長度多態(tài)性標(biāo)記與栽培稻F1花粉育性基因座連鎖[J].分子植物育種,2006,4(3):323-328.

        [2] 曾華宗,鄭成木,朱穩(wěn),等.甘蔗種質(zhì)間親緣關(guān)系及特異標(biāo)記的RAPD分析[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào),2003,4(2):99-100.

        [3] 盧泳全,汪旭升,黃偉素,等.基于水稻內(nèi)含子長度多態(tài)性開發(fā)禾本科擴(kuò)增共有序列遺傳標(biāo)記[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,39(3):433-439.

        [4] 王得元,鄧義才,李乃堅(jiān).RAPD標(biāo)記檢測蔬菜種子純度中DNA提取方法研究[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),1999(3):13-14.

        [5] 高必達(dá),程毅,朱水芳,等.基于ITS序列的菟絲子PCR鑒定[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2006,32(4):368-370.

        [6] 汪旭升,趙向前,盧泳全,等.一種新型的分子標(biāo)記:內(nèi)含子長度多態(tài)性[C]∥2005植物分子育種國際學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集,2005.

        [7] 許紹斌,陶玉芬,楊昭慶,等.簡單快速的DNA銀染和膠保存方法[J].遺傳,2002,24(3):335-336.

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