楊家強， 王相晶， 郭兆將， 朱 勛， 吳青君＊，謝 文， 王少麗， 徐寶云， 張友軍

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

簡單重復(fù)序列間區(qū)（inter simple sequence repeat，ISSR）是由 Zietkiewicz等人［1］開發(fā)的一種基于SSR的分子標(biāo)記。這種新型方法用錨定的微衛(wèi)星DNA為引物，即在SSR序列的3′端或5′端加上2～4個隨機核苷酸，擴增反向排列的間隔不太長的2個SSR之間的序列，可以通過PCR技術(shù)揭示基因組中微衛(wèi)星序列的變異。與微衛(wèi)星及其他分子標(biāo)記相比，ISSR標(biāo)記具有操作簡單，DNA用量少，可重復(fù)性好，成本低，呈孟德爾遺傳，無須預(yù)知研究對象的基因組序列等特點，其所揭示的多態(tài)性比RFLP、RAPD和SSR更高，具有廣泛的應(yīng)用前景。這種方法常被應(yīng)用于親緣關(guān)系鑒定［2－4］、種質(zhì)資源和遺傳多樣性研究［5－7］，并被作為構(gòu)建遺傳圖譜的工具［8］。

雖然ISSR－PCR具有重復(fù)性好的特點，但是IS－SR－PCR是基于PCR反應(yīng)的分子標(biāo)記方法，Mg2＋濃度、dNTPs濃度、引物濃度以及Taq酶和模板DNA用量都會影響ISSR－PCR反應(yīng)擴增效果［9］，而且ISSR－PCR最佳反應(yīng)體系在不同的物種中各不相同［10］。小菜蛾（Plutella xylostella）是影響十字花科蔬菜產(chǎn)量和質(zhì)量最重要的害蟲，因其繁殖率高、世代重疊嚴(yán)重、易產(chǎn)生抗藥性，因此防治困難。Saw等利用mtCOI基因標(biāo)記研究了澳大利亞小菜蛾，發(fā)現(xiàn)澳大利亞不同地理種群小菜蛾的mtDNA分化程度較低［11］。Endersby等通過對澳大利亞、新西蘭等17個地區(qū)的小菜蛾進行SSR標(biāo)記研究，發(fā)現(xiàn)澳大利亞小菜蛾種群與韓國、馬來西亞種群存在較大的遺傳分化［12］。由于ISSR－PCR各因素之間相互影響，為了保證ISSR－PCR結(jié)果的重復(fù)性和可靠性，必須搞清楚各因素之間的相互作用，所以非常有必要對小菜蛾ISSR－PCR反應(yīng)體系進行優(yōu)化，建立最佳反應(yīng)體系。本文采用正交設(shè)計的方法，選用L16（45）正交表，從Mg2＋濃度、dNTPs濃度、引物濃度以及Taq酶和模板DNA用量5種因素4個水平對小菜蛾ISSR－PCR反應(yīng)體系進行優(yōu)化，在此基礎(chǔ)上對退火溫度及反應(yīng)循環(huán)次數(shù)進行比較分析，建立了適用于小菜蛾的ISSR－PCR最佳反應(yīng)體系，為小菜蛾的多態(tài)性分析和分子生態(tài)學(xué)研究提供試驗支持，為利用分子標(biāo)記技術(shù)進行抗藥性及種群遺傳關(guān)系的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

小菜蛾種群：在本實驗室養(yǎng)蟲室內(nèi)用無蟲甘藍苗進行繼代飼養(yǎng)，具體方法參見楊峰山等［13］，稍做改動。

1.2 基因組DNA的提取

采集小菜蛾成蟲每3頭為一管進行基因組DNA提取，提取方法按照TIANamp Genomic DNA Kit（TIANGEN BIOTECH CO.，LTD.）說明書進行。用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，Nanodrop 2000c分光光度計（Thermo Scientific公司）測定其濃度和純度，并將DNA樣品稀釋至40ng／μL，用于ISSRPCR反應(yīng)條件的優(yōu)化試驗。

1.3 優(yōu)化ISSR－PCR反應(yīng)體系的正交設(shè)計

為確定小菜蛾ISSR－PCR反應(yīng)的最佳擴增條件，經(jīng)初步篩選，引物886作為此次正交試驗的引物，分別對 Mg2＋濃度、Taq DNA 聚合酶用量、dNTPs濃度、模板DNA和引物濃度用量5個主要影響因素各4個水平作正交試驗。選用L16（45）正交表，設(shè)計PCR擴增體系各成分的因素－水平正交設(shè)計試驗（表1，表2）。反應(yīng)體系均為20.0μL，每管各加2.0μL 10×PCR Buffer（不含 Mg2＋），然后按照各組分母液濃度計算各因素用量，不足體積用無菌雙蒸水補充，PCR產(chǎn)物用2.0%的瓊脂糖電泳檢測。結(jié)果依據(jù)瓊脂糖電泳條帶的強弱和雜帶的多少做直觀分析。

表1 ISSR－PCR反應(yīng)體系的因素與水平

表2 ISSR－PCR正交試驗設(shè)計［L16（45）］1）

1.4 ISSR－PCR的擴增反應(yīng)

用于ISSR－PCR反應(yīng)的 Mg2＋、dNTPs、ES Taq酶購自康為世紀(jì)公司，標(biāo)準(zhǔn)分子量（marker）200bp Ladder購自天根生物技術(shù)有限公司，引物參照加拿大British Columbia大學(xué)提供的ISSR引物序列［14］，Invitrogen公司合成。PCR反應(yīng)在S1000型PCR循環(huán)儀（BIO－RAD公司）上進行。擴增程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性45s，X℃（不同引物退火溫度各異）退火1.0min，72℃延伸1.5min，35個循環(huán)；72℃延伸10.0min；10℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，擴增產(chǎn)物在質(zhì)量濃度2.0%的瓊脂糖凝膠上電泳分離，電壓150V。在ChemiDocTMXRS＋凝膠成像系統(tǒng)（BIO－RAD公司）上觀察并照相記錄。利用Quantity one分析條帶數(shù)目及明亮程度。

1.5 退火溫度梯度篩選

利用以上正交試驗建立的小菜蛾ISSR－PCR反應(yīng)的最佳體系，從100個ISSR引物中根據(jù)Tm值上下浮動8.0℃設(shè)定退火溫度范圍，PCR儀自動生成溫度梯度進行篩選，篩選出擴增穩(wěn)定、重復(fù)性好的引物。對反應(yīng)程序的循環(huán)次數(shù)進行優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 直觀分析法評分

小菜蛾正交ISSR－PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1，利用直觀分析法［15］對16個處理從高到低依次打分，條帶數(shù)量豐富、清晰度高、背景低的最佳產(chǎn)物記為25，與此相反，最差的記為1。從左至右依次的計分為：21、24、22、23、3、15、20、20、12、18、4、5、4、6、17、10；重復(fù)電泳的結(jié)果與第1個結(jié)果有較大的一致性，評分結(jié)果：22、24、23、22、4、13、21、21、11、17、3、5、3、5、15、9。

2.2 各因素影響ISSR－PCR反應(yīng)的差異分析

采用DPS軟件對結(jié)果進行方差分析，由F值可知Mg2＋對PCR反應(yīng)影響最大，Taq酶最小。各因素水平變化對PCR反應(yīng)影響從大到小依次為：Mg2＋、模板 DNA、dNTPs、引物、Taq酶，由于各因素水平間的差異均達到顯著水平，需進一步做因素內(nèi)多重比較。

圖1 ISSR－PCR反應(yīng)正交試驗電泳結(jié)果

2.2.1 Mg2＋對小菜蛾ISSR－PCR體系的影響

對Mg2＋各水平間進行比較分析結(jié)果表明，Mg2＋濃度從1.5～3.0mmol／L擴增結(jié)果均值呈下降趨勢，當(dāng) Mg2＋濃度為1.5mmol／L時均值最高，且與其他3個水平達到極顯著差異水平，1.5mmol／L為Mg2＋最佳反應(yīng)水平（圖2）。

圖2 不同因素與結(jié)果均值的關(guān)系

2.2.2 Taq酶對小菜蛾ISSR－PCR體系的影響

從方差分析可知，Taq酶對PCR擴增影響最小。對酶各水平比較分析表明，隨著酶量的上升結(jié)果均值呈上升趨勢，當(dāng)酶量為3.5U時與其他3水平間的差異達到極顯著水平，但酶量過高背景加深，且其他3個水平未達到顯著差異（圖2），綜合考慮以2.5U水平為最佳反應(yīng)水平。

2.2.3 dNTPs對小菜蛾ISSR－PCR體系的影響

dNTPs水平間比較的結(jié)果表明，隨著dNTPs濃度從0.15～0.25mmol／L擴增結(jié)果均值增大，增加到0.30mmol／L時反而下降，濃度0.20mmol／L和0.25mmol／L未達到顯著水平，但與其他兩個水平差異顯著（圖2），綜合考慮以0.20mmol／L水平為最佳反應(yīng)水平。

2.2.4 模板DNA對小菜蛾ISSR－PCR體系的影響

從方差分析可知，模板DNA對PCR擴增影響很大。隨著模板DNA濃度升高，擴增結(jié)果均值呈下降趨勢，濃度為20ng時擴增結(jié)果均值最大且與其他水平的差異達到極顯著水平，選擇20ng為最佳水平（圖2）。

2.2.5 引物對小菜蛾ISSR－PCR體系的影響

由方差分析可知，在0.50～1.25μmol／L內(nèi)隨著濃度的增加而升高，在1.25μmol／L時達到峰值（圖2），與其他3個水平差異顯著，因此選擇峰值1.25μmol／L為最佳水平。

2.3 循環(huán)次數(shù)對小菜蛾ISSR－PCR體系的影響

循環(huán)次數(shù)對擴增產(chǎn)物的量具有重要的影響，循環(huán)次數(shù)不足，擴增產(chǎn)物量不足，部分譜帶不能檢測；反應(yīng)到達平臺期后，循環(huán)次數(shù)增多不會使產(chǎn)物明顯增加，反而引起非特異性擴增，發(fā)生錯配的比例比較高，引起彌散現(xiàn)象。該試驗通過對3個（35、40、45）循環(huán)數(shù)的篩選，以40個循環(huán)數(shù)的擴增產(chǎn)物豐富、亮度高、清晰度好（圖3）。

圖3 不同循環(huán)次數(shù)的電泳結(jié)果

2.4 退火溫度對小菜蛾ISSR－PCR體系的影響

PCR反應(yīng)中，退火溫度對擴增產(chǎn)物的影響較大，較低的退火溫度允許適當(dāng)錯配，擴大了引物在基因組中配對的隨機性，而較高的退火溫度雖可提高配對專一性，卻影響引物與模板的結(jié)合程度（圖4）。

圖4 溫度梯度PCR結(jié)果

根據(jù)正交試驗結(jié)果結(jié)合Tm值進行溫度梯度PCR，從100個ISSR引物中進行引物篩選，試驗所確定的17條引物的最適退火溫度見表3。

表3 引物序列及最適退火溫度1）

3 小結(jié)與討論

本研究發(fā)現(xiàn) Mg2＋濃度、模板DNA用量以及dNTPs濃度對小菜蛾ISSR－PCR擴增效果有顯著影響。Mg2＋是Taq酶的激活劑，其濃度影響Taq酶的活性并且影響引物與模板的結(jié)合效率。低濃度Mg2＋使Taq酶活性降低，擴增效率低甚至無擴增產(chǎn)物［16］。而高濃度 Mg2＋容易發(fā)生PCR錯配產(chǎn)生非特異性擴增，造成背景彌散，試驗確定Mg2＋的最優(yōu)濃度為1.5mmol／L。模板DNA用量影響引物與模板的結(jié)合幾率，直接影響擴增產(chǎn)量，試驗確定最優(yōu)模板DNA用量為20ng。本研究發(fā)現(xiàn)，模板DNA濃度是影響小菜蛾ISSR－PCR反應(yīng)的關(guān)鍵因素之一，其純度也很重要，當(dāng)模板DNA中含有少量RNA對ISSR擴增無明顯影響，但是當(dāng)模板DNA中殘留較多的蛋白質(zhì)，異丙醇，乙醇等雜質(zhì)時往往會產(chǎn)生彌散，影響擴增效果，這與賀佳等［17］的研究結(jié)果一致。在反應(yīng)體系中，dNTPs分子的磷酸基團能定量的與Mg2＋結(jié)合，高濃度的dNTPs會造成Mg2＋的拮抗作用，使實際反應(yīng)中的Mg2＋濃度下降［18］，經(jīng)過優(yōu)化得到dNTPs最適濃度為0.2mmol／L。

此外，ISSR－PCR還受到退火溫度，循環(huán)次數(shù)的影響。退火溫度過低，擴增特異性差，雜帶較多，背景深，不利于統(tǒng)計結(jié)果；隨溫度升高，特異性增強，但退火溫度過高影響引物與模板DNA的結(jié)合，電泳條帶弱，甚至沒有擴增［19］。本研究根據(jù)引物Tm 值，進行Tm±8℃溫度梯度篩選，確定了17條引物的退火溫度（見表3）。試驗表明：不同引物的最適退火溫度不同，不能以單一的退火溫度進行所有引物的試驗［20］，同一引物對于不同的物種，退火溫度可能不同。循環(huán)次數(shù)決定擴增程度，循環(huán)次數(shù)過多增加非特異性擴增產(chǎn)物的數(shù)量和復(fù)雜性［21］，通過不同循環(huán)次數(shù)的對比，確定小菜蛾ISSR－PCR反應(yīng)以40個循環(huán)最佳。

本文采用正交試驗設(shè)計方法，以小菜蛾基因組DNA為模板DNA，篩選出小菜蛾ISSR－PCR的最優(yōu)反應(yīng)體系（20μL）為：Mg2＋濃度1.5mmol／L、Taq DNA聚合酶2.5U、dNTPs濃度0.2mmol／L、引物濃度1.25μmol／L、模板DNA量20ng。與單、雙因素設(shè)計相比，兼顧了各因素之間的互作，減少了處理組合，大大節(jié)約了時間，降低了試驗成本。為小菜蛾遺傳多樣性分析等提供了重要支持。

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