鄒月利， 陶 波

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150030）

氯嘧磺?。╟hlorimuron－ethyl）又稱豆磺隆，是美國杜邦公司于20世紀(jì)80年代開發(fā)的一種磺酰脲類除草劑。它的化學(xué)名稱為［2－（4－氯－6－甲氧基嘧啶－2－氨基甲酰氨基磺?；┍郊姿嵋阴ィ荨Ｂ揉谆锹闊o色晶體，是一種弱酸性化合物，pKa＝4.3。該類除草劑能防治大多數(shù)闊葉雜草，對禾本科雜草也有一定的抑制效果［1－3］。此類除草劑為內(nèi)吸傳導(dǎo)型選擇性除草劑，作用靶標(biāo)為植物體內(nèi)的乙酰乳酸合成酶（ALS），可有效抑制氨基酸的生物合成，導(dǎo)致底物α－丁酮的積累，阻礙細(xì)胞分裂期間DNA的合成，最終達(dá)到除草目的［4－5］?；酋ｋ孱惓輨┰谕寥乐袣埿陂L，極低的殘留量就可以對后茬敏感作物產(chǎn)生藥害，嚴(yán)重影響種植結(jié)構(gòu)的調(diào)整。同時，因其用量低、對哺乳動物低毒以及獨(dú)特的除草活性等特點(diǎn)而受到人們廣泛應(yīng)用［6］。

磺酰脲類除草劑在土壤中的降解主要包括光解、水解和微生物降解3種途徑。其中光解作用較少，大多只發(fā)生在土壤表層；化學(xué)水解大多發(fā)生在酸性及中性土壤中；在堿性土壤中，微生物對降解起著非常重要的作用。其中，pH、溫度、濕度和土壤類型等環(huán)境因子均能影響微生物降解除草劑的除草活性［7－9］。目前，關(guān)于微生物降解除草劑的文獻(xiàn)很多，尤其是在水環(huán)境和土壤中降解效果顯著。因此，利用微生物降解該類除草劑污染將具有較大的應(yīng)用潛力［10－12］。試驗(yàn)利用本科研室篩選的高效降解菌黑曲霉（TR－H）對在不同培養(yǎng)條件下的氯嘧磺隆降解特性進(jìn)行了深入研究，采用二氯甲烷提取，利用HPLC對反應(yīng)液中氯嘧磺隆定量檢測，從而確定其最佳的降解條件。

1 材料及方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1100高效液相色譜儀，配有自動進(jìn)樣器和紫外檢測器，美國Agilent公司；KL512氮吹濃縮儀，東聯(lián)儀器設(shè)備有限公司；R－205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海中勝有限公司；AL－104電子天平，瑞士梅特勒－托利多儀器公司；TGL－16G超速冷凍離心機(jī)，上海安亭儀器公司。

甲醇、二氯甲烷（進(jìn)口色譜純）；娃哈哈純凈水；氯嘧磺隆標(biāo)準(zhǔn)品購自大連瑞澤農(nóng)藥有限公司，純度大于97.4%；其他試劑均為分析純。真菌黑曲霉（TR－H）為東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥學(xué)科研室自行分離、保存的高效降解菌株。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件

液相色譜采用 Agilent－ZORBAX SB－C18色譜柱（4.6mm×150mm，5.0μm），檢測波長為254.0nm，柱溫為28.0℃，進(jìn)樣體積20.0μL。流動相采用V（甲醇）∶V（水）（pH 2.5，用85.0%磷酸調(diào)節(jié)）＝75∶25，流速為0.8mL／min。

1.2.2 培養(yǎng)基的配制

PDA斜面培養(yǎng)基：取馬鈴薯200.0g，洗凈去皮后切碎，加水煮沸30.0min，用斜面菌種的培養(yǎng)紗布過濾后加入20.0g葡萄糖和15.0g瓊脂，蒸餾水1 000.0mL，121℃高壓滅菌15min。

察式（基礎(chǔ)）培養(yǎng)基：葡萄糖20.0g，蛋白胨5.0g，K2HPO41.0g，KCl 0.5g，MgSO40.5g，NaNO33.0g，F(xiàn)eSO40.1g，蒸餾水1 000.0mL，121 ℃高壓滅菌15min［13－14］。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取純度為97.4%的氯嘧磺隆原藥0.102 6g于100mL燒杯中，加30mL甲醇溶液使之溶解，定量轉(zhuǎn)移至100.0mL容量瓶中，然后定容至刻度線，搖勻。得到氯嘧磺隆標(biāo)準(zhǔn)儲備液的濃度為1 000.0mg／L，最后用甲醇稀釋成濃度依次為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、40.0、80.0、120.0、160.0、200.0mg／L 氯嘧磺隆標(biāo)準(zhǔn)溶液，用液相色譜法進(jìn)行檢測。

1.2.4 最佳培養(yǎng)條件的確定

向250mL三角瓶內(nèi)分別裝入95.0mL不同pH的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用封口膜封好后，在121.0℃條件下高溫滅菌2.0h。滅菌完畢、待冷卻后，分別向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入氯嘧磺隆儲備液，使其成為不同濃度的反應(yīng)液。然后再加入黑曲霉種子液，以不加黑曲霉降解菌作為對照，每組設(shè)置3個重復(fù)。最后將三角瓶置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，在150r／min的搖床上在一定溫度條件下避光振蕩培養(yǎng)。每隔一定時間取樣，采用液相色譜檢測，從而考察不同條件下黑曲霉種子液對氯嘧磺隆除草劑的降解作用。

1.2.4.1 接種量對降解的影響

分別加入1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0mL黑曲霉種子液，進(jìn)行降解試驗(yàn)，考察不同接種量對黑曲霉種子液降解氯嘧磺隆除草劑的影響。

滿足發(fā)電運(yùn)行工況通常要求改變原機(jī)組的旋轉(zhuǎn)方向，高壓側(cè)的相序也隨之改變；對于WKLF-102B勵磁裝置則必須在調(diào)節(jié)器的配置參數(shù)上作出相應(yīng)調(diào)整。發(fā)電運(yùn)行時有功功率方向?qū)l(fā)生改變，由于發(fā)電工況運(yùn)行時輸出的有功功率通常比較低，功率因數(shù)自動調(diào)節(jié)方式的穩(wěn)定性及對電網(wǎng)波動的適用能力都有可能變得很差，因此，在發(fā)電運(yùn)行時不建議使用電動工況的恒功率因數(shù)自動調(diào)節(jié)方式。

1.2.4.2 培養(yǎng)時間對降解的影響

每隔0、1、3、5、7、15d取樣，考察不同培養(yǎng)時間對黑曲霉種子液降解氯嘧磺隆除草劑的影響。

1.2.4.3 濃度對降解的影響

分別向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入氯嘧磺隆儲備液，使其濃度分別為 1.0、10.0、50.0、100.0mg／L 和200.0mg／L的反應(yīng)液，進(jìn)行降解試驗(yàn)，考察黑曲霉種子液對不同濃度氯嘧磺隆除草劑的降解作用。

1.2.4.4 溫度對降解的影響

分別在20.0、25.0、30.0、35.0℃和40.0 ℃條件下，進(jìn)行降解試驗(yàn)，考察在不同培養(yǎng)溫度條件下黑曲霉種子液對氯嘧磺隆除草劑的降解作用。

1.2.4.5 pH 對降解的影響

緩沖溶液pH 分別為5.0、7.0、9.0的反應(yīng)液，以不調(diào)pH為對照，進(jìn)行降解試驗(yàn)，考察在不同pH條件下黑曲霉種子液對氯嘧磺隆除草劑的降解作用。

每隔一定時間，在無菌操作臺上取樣5.0mL降解液于10.0mL離心管內(nèi)；在15 000r／min、4℃條件下離心10.0min后取上清液3.0mL，加1.0g固體氯化鈉（防止乳化），搖勻、使之完全溶解后，加5.0mL（3.0mL＋2.0mL）二氯甲烷萃取2次、合并有機(jī)層，加0.5g左右的無水硫酸鈉干燥，將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管內(nèi)，然后用氮?dú)獯蹈?，用甲醇定容?.5mL。最后用0.45μm的微孔濾膜過濾，用HPLC測定其降解率。

2 結(jié)果和討論

2.1 方法的線性

根據(jù)液相色譜測定結(jié)果，以氯嘧磺隆除草劑原藥的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線（如圖1）。得到回歸方程y＝25.837x－2.196，相關(guān)系數(shù)為R＝0.999 9（n＝3）。結(jié)果表明，氯嘧磺隆除草劑在0.1～200.0mg／L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，可以滿足定量分析的要求。

圖1 氯嘧磺隆的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

2.2 最佳培養(yǎng)條件的測定結(jié)果

2.2.1 接種量對降解的影響

待反應(yīng)液培養(yǎng)7d時測定氯嘧磺隆的降解率，得到降解曲線（如圖2）。結(jié)果表明，黑曲霉接種量在4.0～7.0mL時降解率變化較平緩，而在1.0～4.0mL和7.0～10.0mL時降解率的變化幅度較大。該結(jié)果表明，黑曲霉的接種量為5.0mL左右時氯嘧磺隆降解速率最大，降解率最高能達(dá)到96.49%。

2.2.2 培養(yǎng)時間對降解的影響

將反應(yīng)液每隔0、1、3、5、7、15d測定氯嘧磺隆的降解率，得到降解曲線（如圖3）。結(jié)果表明，反應(yīng)液培養(yǎng)1d時黑曲霉菌株的降解率為22.80%，培養(yǎng)7d時降解率為96.25%，培養(yǎng)15d時降解率為98.06%。該結(jié)果表明，黑曲霉菌株在培養(yǎng)24h時開始降解氯嘧磺隆，培養(yǎng)到7d即可將氯嘧磺隆基本降解完全。

2.2.3 濃度對降解的影響

待反應(yīng)液培養(yǎng)7d時測定氯嘧磺隆的降解率，得到降解曲線（如圖4）。結(jié)果表明，黑曲霉菌株在含有濃度依次為1.0、10.0、50.0、100.0mg／L氯嘧磺隆培養(yǎng)基中的降解能力明顯高于在含有200.0mg／L氯嘧磺隆培養(yǎng)基中的降解力，其中氯嘧磺隆含量為10.0mg／L培養(yǎng)基的降解率最高，為96.49%。隨著氯嘧磺隆濃度的增加，黑曲霉降解除草劑的能力逐漸降低，當(dāng)氯嘧磺隆的濃度增加到200.0mg／L時，降解率為90.79%。

2.2.4 溫度對降解的影響

待反應(yīng)液培養(yǎng)7d時測定氯嘧磺隆的降解率，得到降解曲線（如圖5）。結(jié)果表明，反應(yīng)液的溫度為20.0℃時，氯嘧磺隆的降解率為84.74%。隨著反應(yīng)液溫度的升高，黑曲霉菌株對氯嘧磺隆的降解速率隨之增加，當(dāng)溫度升至30.0℃左右時降解率最高，為97.21%。

2.2.5 pH 對降解的影響

將反應(yīng)液每隔0、1、3、5、7d測定氯嘧磺隆的降解率，繪成降解曲線（如圖6）。結(jié)果表明，氯嘧磺隆在pH為7.0的反應(yīng)液降解效率最低，在對照培養(yǎng)基中氯嘧磺隆的降解率最高，在pH為5.0和9.0的反應(yīng)液降解速率基本相同。

圖6 不同pH對黑曲霉降解氯嘧磺隆作用的影響

3 結(jié)論

試驗(yàn)系統(tǒng)地研究了在不同影響因素條件下，真菌黑曲霉對氯嘧磺隆降解作用的影響。確立了黑曲霉在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中最適宜的培養(yǎng)條件：氯嘧磺隆濃度 為 10.0mg／L、溫 度 為 30.0 ℃、接 種 量 為5.0mL。雖然該菌株的最適培養(yǎng)溫度為30.0℃，但在25.0℃和40.0℃時仍保持較好的降解活性。所以，該菌株在治理受氯嘧磺隆污染的土壤以及地下水和工業(yè)廢水等方面將具有較大的應(yīng)用潛力［15］。

［1］ Barragán H B，Costa P C，Peralta C J，et al.Biodegradation of organochlorine pesticides by bacteria grown in microniches of the porous structure of green bean coffee［J］.International Biodeterioration ＆ Biodegradation，2007，59（3）：239－244.

［2］ 滕春紅，陶波.氯嘧磺隆高效降解真菌F8的分離和鑒定［J］.土壤通報(bào)，2008，39（5）：1160－1163.

［3］ 歐曉明，步海燕.磺酰脲類除草劑水化學(xué)降解機(jī)理研究進(jìn)展［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2007，26（5）：1607－1614.

［4］ Stasinakis A S，Kotsifa S，Gatidou G，et al.Diuron biodegradation in activated sludge batch reactors under aerobic and anoxic conditions［J］.Water Research，2009，43（5）：1471－1479.

［5］ 閆春秀，趙長山，劉亞光.微生物降解長殘效除草劑的研究進(jìn)展［J］.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，36（5）：650－654.

［6］ Ha J，Engler C R，Wild J R.Biodegradation of coumaphos，chlorferon，and diethylthiophosphate using bacteria immobilized in Ca－alginate gel beads［J］.Bioresource Technology，2009，100（3）：1138－1142.

［7］ 滕春紅.氯嘧磺隆對土壤微生態(tài)的影響及其高效降解菌的研究［D］.哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

［8］ 任洪雷.抗氯嘧磺隆菌株TR－H的鑒定及其AnALS1基因的克隆與表達(dá)研究［D］.哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

［9］ Matocha M A，Kruta L J，Reddy K N，et al.Foliar washoff potential and simulated surface runoff losses of trifloxysulfuron in cotton［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2006，54（15）：5498－5502.

［10］ 郎印海，蔣新，趙其國，等.磺酰脲除草劑在土壤中的環(huán)境行為研究進(jìn)展［J］.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2002，13（9）：1187－1190.

［11］ 滕春紅，陶波.除草劑氯嘧磺隆對土壤酶活性的影響［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2006，25（5）：1294－1298.

［12］ Bellinaso M D L，Greer C W，Peralba M C，et al.Biodegradation of the herbicide trifluralin by bacteria isolated from soil［J］.Microbiology Ecology，2003，43（2）：191－194.

［13］ 楊亞君.水體中煙嘧磺隆的微生物降解代謝研究［D］.保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

［14］ Kumar M，Philip L.Enrichment and isolation of a mixed bacterial culture for complete mineralization of endosulfan［J］.Journal of Environmental Science and Health（Part B），2006，41（1）：81－96.

［15］ 滕春紅，陶波，趙世君.高效降解真菌對大豆田除草劑氯嘧磺隆的降解特性研究［J］.大豆科學(xué)，2006，25（1）：58－61.