王連春， 彭杰軍， 郭維霞， 李曉鵬， 孔寶華， 陳海如

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物多樣性與病蟲害控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650201）

香石竹（Dianthus caryophyllus Linn.）又名康乃馨（carnation），是一種深受人們喜愛的鮮切花。香石竹能受多種病毒侵染危害，其中影響最大的是香石竹斑駁病毒（Carnation mottle virus，CarMV），屬于番茄叢矮病毒科（Tombusviridae）麝香石竹斑駁病毒屬（Carmovirus）。CarMV是麝香石竹斑駁病毒屬的典型成員，其全長(zhǎng)約4003nt（GenBank：AF192772），可能有5個(gè)閱讀框架（圖1），分別為p28ku、p28ku通讀產(chǎn)生的p88ku、p7ku、p9ku、p38ku；其中p88可能具有RNA依賴的RNA聚合酶功能，p7和p9可能都具有運(yùn)動(dòng)蛋白功能，而p38則執(zhí)行外殼蛋白功能［1－2］。但是否存在 CarMVgp1兩個(gè)TAG終止子通讀框架還有待進(jìn)一步證明。目前深入研究較多的是p7和p38兩個(gè)蛋白，研究表明p7可能具有運(yùn)動(dòng)蛋白的功能，其C末端具有RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域［3］，蛋白定位表明在病毒侵染擴(kuò)散時(shí)p7會(huì)在細(xì)胞壁附近富集［4］，這也與運(yùn)動(dòng)蛋白可以輔助病毒通過胞間連絲運(yùn)動(dòng)的結(jié)果相符；而p38作為外殼蛋白是保護(hù)病毒的屏障［5］，也是直接與外界接觸的部分，因此p38蛋白也經(jīng)常作為CarMV病毒檢測(cè)的抗原［6－8］。由于外殼蛋白執(zhí)行保護(hù)作用，為了適應(yīng)不同環(huán)境其變異也會(huì)比較大，科研工作者通常將外殼蛋白作為病毒進(jìn)化分類的重要依據(jù)，CarMV也不例外，Canizares等［9］根據(jù)CP氨基酸序列164和331兩個(gè)位置氨基酸變化的相關(guān)性，把CarMV分為P164K331和A164N331兩個(gè)主要組群。

圖1 CarMV閱讀框架分析

CarMV是一種重要的花卉病毒，對(duì)于它各個(gè)蛋白的功能及其相互關(guān)系的研究是防治CarMV的前提，但目前研究主要集中在病毒檢測(cè)、遺傳進(jìn)化、運(yùn)動(dòng)蛋白和外殼蛋白的研究，對(duì)于其他閱讀框架如p88、p28、p9等的功能研究較少，而且p88、p9、p7、p38四個(gè)蛋白的核苷酸序列都有不同程度的重疊，這種表達(dá)方式對(duì)于CarMV是否具有一定的生物學(xué)意義僅通過單獨(dú)閱讀框架的表達(dá)很難進(jìn)行研究；再者CarMV的原始寄主是香石竹，其遺傳背景不清楚無法直接進(jìn)行病毒與寄主間互作研究，因此構(gòu)建CarMV的全長(zhǎng)侵染克隆是解決以上問題的快捷方法。本研究旨在構(gòu)建一個(gè)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的能侵染煙草等模式植物的CarMV cDNA全長(zhǎng)侵染性克隆，從而滿足進(jìn)一步研究CarMV病毒的需要。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 感病樣品

13個(gè)具有典型病害癥狀（如植株矮化，畸形，生長(zhǎng)衰弱，花朵變小或雜色，花苞開裂等）的香石竹樣品來源于昆明市斗南花卉市場(chǎng)。

1.1.2 質(zhì)粒與菌株

真核表達(dá)載體pCV－nGFP、大腸桿菌［Escherichia coli（Migula）Castellani et Chalmers］DH5α、農(nóng) 桿 菌 ［Agrobacerium tumefaciens （Smith Townsend）Conn］C58C1由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院病毒學(xué)與生物技術(shù)研究所陳劍平院士惠贈(zèng)。

1.1.3 酶及試劑

RNeasy Plant mini Kit、QIAquick Gel Purification Kit購自 QIAGEN公司；T4DNA Ligase、pGEM－T vector購自Promega公司；EX TaqTM、各種限制性內(nèi)切酶、Ribonuclease H（RNase H）、Ribonuclease Inhibitor、AMV Reverse Transcriptase、DNA Ligation Kit ver.2、pMD19－T購自TaKaRa。

1.1.4 引物

根據(jù)登錄號(hào)為NC＿001265.1的上海分離物設(shè)計(jì)引物（表1），引物合成由上海生工生物工程有限公司完成。

表1 CarMV全長(zhǎng)序列構(gòu)建引物

利用BamHI（GGATCC）、KpnI（GGTACC）和SacI（GAGCTC）將病毒片段分為兩段連入pCV－nGFP為載體。

1.2 方法

1.2.1 CarMV RT－PCR檢測(cè)及全基因組序列克隆

參照Invitrogen公司的Trizol法提取植物總RNA，以提取的總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄后利用Car－MV－3和CarMV－4PCR擴(kuò)增CarMV全長(zhǎng)，回收目的片段連接到pMD19－T載體，藍(lán)白斑篩選出陽性克隆，送生工測(cè)序。

1.2.2 農(nóng)桿菌浸潤(rùn)

將構(gòu)建好的侵染性克隆載體pCV－CarMV通過電擊法導(dǎo)入農(nóng)桿菌C58C1，再挑取單菌落接種于5mL LB液體培養(yǎng)基中，220r／min 28℃振蕩培養(yǎng)24h。取500μL菌液轉(zhuǎn)接于5mL LB液體培養(yǎng)基中，28℃220r／min振蕩培養(yǎng)至A600＝0.6。5 000r／min離心10min收集菌體用轉(zhuǎn)染緩沖液（10mmol／L MES、10mmol／L MgCl2和150μmol／L乙酰丁香酮）懸浮，A600調(diào)至1.0，室溫放置12h后通過5mL針筒浸潤(rùn)到6葉期本氏煙。pCV－CarMV農(nóng)桿菌侵染時(shí)每次接種10株6葉期本氏煙，重復(fù)3次，同時(shí)以浸潤(rùn)空載體農(nóng)桿菌為陰性對(duì)照。

1.2.3 CarMV侵染植物 RT－PCR檢測(cè)

對(duì)浸潤(rùn)C(jī)arMV和對(duì)照煙草植株提取系統(tǒng)葉片總RNA，以O(shè)ligdT為引物反轉(zhuǎn)錄CarMV的cDNA第1鏈，以CarMV－C－2f和CarMV－C－2r為引物進(jìn)行RT－PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 CarMV RT－PCR檢測(cè)及全基因組序列測(cè)定

為確定所取病樣是否含有CarMV，本試驗(yàn)將斗南花市獲得的樣品提取植物總RNA反轉(zhuǎn)錄，利用特異引物CarMV－1和CarMV－2進(jìn)行RT－PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示所取樣品中有13個(gè)樣品能擴(kuò)增出1 700bp左右的條帶，由此表明此13個(gè)樣品均含有CarMV（圖2）。

圖2 斗南花市13個(gè)香石竹樣品CarMV PCR檢測(cè)

為獲得CarMV云南分離物的全長(zhǎng)序列，本試驗(yàn)以其中一個(gè)樣品為模板，利用引物CarMV－3和CarMV－4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得病毒全長(zhǎng)序列連入pMD19－T，構(gòu)建的重組質(zhì)粒為T－CarMV送至生工測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，CarMV云南分離物RNA全長(zhǎng)共4 003bp（登錄號(hào) HQ660513.1）。軟件DNAMAN分析云南分離物與上海分離物（登錄號(hào)為NC＿001265.1）的差異，結(jié)果表明，兩者相似性達(dá)94.78%。對(duì)兩者的氨基酸分析表明，p88（805～807位置的TAG通讀）氨基酸序列相似性100%；而p9有兩個(gè)氨基酸差異，分別為第11位E→G，第14位M→L；p7序列第3位A→V，第7位P→L，第23位R→K；p38變化較大有6處差異，分別為第67位S→P，第92位C→S，第284位I→F，第329位M→I，第341位K→Q，第342位V→W。序列比較結(jié)果顯示，上海分離物與云南分離物之間沒有顯著差異。而根據(jù)Canizares等提供的分類標(biāo)準(zhǔn)顯示，云南分離物和上海分離物第164位為P，第331位為K，它們同屬于P164K331組群。

2.2 侵染性克隆構(gòu)建

本試驗(yàn)以T－CarMV為模板將CarMV全長(zhǎng)序列構(gòu)建至真核表達(dá)載體以便于農(nóng)桿菌瞬時(shí)轉(zhuǎn)染植物。CarMV－YN全基因序列分析表明，該基因組序列無BamHI和SacI酶切位點(diǎn)、在2 958bp位置具有KpnI酶切位點(diǎn)，因此本試驗(yàn)利用這3個(gè)酶切位點(diǎn)將CarMV分為兩段連入表達(dá)載體。

經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)，CarMV云南分離物先將引物CarMV－C－1f和CarMV－C－1r擴(kuò)增獲得的約3.0kb序列通過BamHI和KpnI酶切后連入pCV－nGFP載體構(gòu)建成pCV－BK，經(jīng)PCR擴(kuò)增檢測(cè)正確后（圖3），繼續(xù)將CarMV－C－2f和CarMV－C－2r擴(kuò)增獲得的約1.0kb片段通過KpnI和SacI連入pCV－BK形成最終重組載體pCV－CarMV，利用PCR檢測(cè)片段2的連接情況（圖4），為進(jìn)一步確認(rèn)構(gòu)建載體的正確性，以CarMVC－1f和CarMV－C－2r為配對(duì)引物進(jìn)行全長(zhǎng)PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示在4.0kb位置有擴(kuò)增條帶（圖5），測(cè)序結(jié)果也表明CarMV全長(zhǎng)已經(jīng)構(gòu)建至雙元表達(dá)載體，可以用于侵染性分析。

圖5 CarMV云南分離物侵染性克隆全長(zhǎng)PCR檢測(cè)

2.3 侵染性分析

為驗(yàn)證構(gòu)建的CarMV－YN全長(zhǎng)侵染性克隆是否具有侵染性，本研究將pCV－CarMV轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌C58C1，浸潤(rùn)6葉期本氏煙，同時(shí)以pCV－nGFP浸潤(rùn)6葉期本氏煙為陰性對(duì)照。轉(zhuǎn)染7d后浸潤(rùn)空載體和pCV－CarMV農(nóng)桿菌的本氏煙上均未出現(xiàn)明顯癥狀。CarMV－C－2f、CarMV－C－2r引物進(jìn)行RT－PCR擴(kuò)增能檢測(cè)到一條1.0～1.1kb特異性條帶（圖6A），而對(duì)照沒有相應(yīng)條帶。14d后觀察發(fā)現(xiàn)，浸潤(rùn)有pCV－CarMV農(nóng)桿菌的植株明顯比對(duì)照植株矮小，并有輕微花葉（圖6B）。上述試驗(yàn)結(jié)果表明，本試驗(yàn)構(gòu)建的CarMV全長(zhǎng)克隆具有侵染性。

圖6 煙草系統(tǒng)葉片RT－PCR檢測(cè)及接毒后煙草生長(zhǎng)情況

3 討論

本研究以香石竹CarMV云南分離物為研究材料，結(jié)果表明CarMV云南分離物全長(zhǎng)4 003nt，與上海分離物同屬于P164K331組群，而核苷酸、氨基酸序列表明云南分離物和上海分離物沒有明顯差異，這也與Canizares等［9］研究結(jié)果相符，CarMV沒有明顯的地域和時(shí)間差異。同時(shí)本試驗(yàn)以具有35S啟動(dòng)子的pCV－nGFP雙元表達(dá)載體為基礎(chǔ)，在35S啟動(dòng)子和NOS終止子之間插入CarMV的全長(zhǎng)片段，利用農(nóng)桿菌直接侵染煙草，結(jié)果表明，本研究構(gòu)建的CarMV侵染性克隆具有侵染性。

植物病毒研究一直以來最難解決的是病毒的保存問題，植物病毒需要保存在寄主植物上才能保持侵染活性，而本試驗(yàn)構(gòu)建的pCV－CarMV侵染性克隆以質(zhì)粒的形式離體保存，從而減少保存過程中的繁瑣工作；再者植物病毒復(fù)制速度快，通過不斷的轉(zhuǎn)接也可能導(dǎo)致病毒進(jìn)化從而無法保證病毒序列的保守性，進(jìn)而導(dǎo)致研究結(jié)果差異大，而農(nóng)桿菌介導(dǎo)的侵染性克隆由于質(zhì)?？梢宰晕覐?fù)制從而能保證病毒序列的保守性；寄主?；砸恢笔侵参锊《狙芯康钠款i，由于寄主遺傳背景不清楚，無法了解植物病毒侵染時(shí)植物發(fā)生變化的基因，但是本研究的侵染性克隆是以農(nóng)桿菌介導(dǎo)，通過農(nóng)桿菌直接將雙元表達(dá)載體注入寄主細(xì)胞中再通過35S強(qiáng)啟動(dòng)子啟動(dòng)Car－MV cDNA序列轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生病毒RNA序列，從而達(dá)到侵染的目的，因此也可以在已知遺傳背景的植物如煙草、擬南芥等模式生物中表達(dá)。

本研究全序列測(cè)定表明，CarMV可能具有5個(gè)閱讀框架，其中有p88是通過TAG通讀形成，但是CarMV病毒中是否會(huì)發(fā)生兩個(gè)TAG終止子的通讀翻譯出CarMVgp1蛋白（圖1），CarMVgp1蛋白具有何種功能目前尚未研究；CarMV中p88、p9、p7、p38四個(gè)蛋白其閱讀框架部分序列發(fā)生相互重疊，而這些重疊部分是否具有生物學(xué)功能也尚未可知，因此這些研究都可以通過對(duì)本試驗(yàn)構(gòu)建的全長(zhǎng)侵染性克隆的基因突變或缺失來完成。綜上所述，本研究構(gòu)建的CarMV侵染性克隆在煙草上具有侵染性，在CarMV基因功能、寄主互作等研究中具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

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