陳 曦，趙永芳（解放軍總醫(yī)院國際醫(yī)學中心住院三區(qū)，北京 100853）

Apelin是一種新近發(fā)現(xiàn)的心血管活性多肽，1998年由日本學者利用反向藥理學的方法從牛胃的分泌物中提取并純化出的孤兒受體APJ (apelin- angiotensin receptor-like, APJ) 的內源性配體[1]。Apelin 具有抗心肌損傷、降血壓等方面的作用[2]。Apelin及其受體APJ在心血管組織中表達很高，可以調節(jié)心臟功能，對心臟有保護作用。丹參具有抗缺氧、抗炎、清除自由基等作用，對心肌缺血具有明顯的保護作用[3]。丹參酮IIA作為丹參的主要脂溶性成分，對這種心血管活性多肽apelin及其受體是否有影響，目前相關文獻報道甚少。本實驗采用異丙腎上腺素(isoproterenol,ISO)誘導大鼠急性心肌缺血損傷模型，觀察丹參酮IIA對大鼠血漿和心肌組織apelin和受體APJ的含量和表達的影響以及NO的變化，初步探索其抗心肌缺血損傷的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

雄性SD大鼠（200 ～ 240 g）由維通利華提供。異丙腎上腺素（Sigma公司）；丹參酮IIA（上海第一生化藥業(yè)有限公司）；Trizol（GIBICO公司）；dNTP（Clontech公司）；MMuLV 逆轉錄酶、Taq DNA 聚合酶、RNasin、Oligo (dT) 15 Primer（Promega 公司）。抗APJ的抗體（abcam公司）；抗eNOS 和ser1177-eNOS（CST公司）。其他試劑均為市售分析純。

1.2 大鼠心肌損傷模型的建立及分組

大鼠隨機分為5組：正常對照組，ISO組，丹參酮IIA低、中、高劑量治療組（0.75、1.50、3.0 g·kg-1）。治療組每天灌胃1次，連續(xù)4周。ISO組及丹參酮IIA治療組，第4周始皮下注射ISO，以每天20、10、5 mg·kg-1的遞減劑量注射3 d，再以3 mg·kg-1的劑量注射2 d，建立大鼠心肌缺血損傷模型[4]。正常對照組則注射等量0.9%氯化鈉注射液。

1.3 樣本的采集

末次注射ISO后12 h，戊巴比妥鈉30 mg·kg-1（ip）麻醉大鼠，頸動脈取血分別收集血漿和血清，- 20 ℃凍存。迅速處死大鼠，取出心臟，取少許心尖組織戊二醛固定，心肌組織透射電鏡分析。另取心室組織1份與PBS混合，制備10%組織勻漿，離心取上清液。另取6只主動脈，- 80 ℃凍存，部分做Western blot檢測APJ、eNOS和磷酸化eNOS的蛋白表達含量，部分做PCR檢測apelin和APJ mRNA水平。

1.4 apelin、NO含量測定

采用酶聯(lián)免疫吸附法測定血漿和心肌組織apelin含量；采用硝酸還原法，按試劑盒測定說明書方法測定血清和心肌組織中NO的含量。

1.5 心肌組織apelin及其受體APJ mRNA水平測定

按Trizol說明書提取各組大鼠心肌的總RNA，紫外分光光度計算定量。取2 μg RNA用MMuLV逆轉錄酶及OligodT逆轉錄成單鏈cDNA，再進行PCR擴增。根據(jù)熒光PCR曲線形態(tài)、CT值（閾值循環(huán)數(shù)）、擴增效率來判斷反應體系的優(yōu)劣，最終確定實時熒光定量PCR的反應條件：95 ℃ 10 s，95 ℃ 10 s，65 ℃ 40 s，40個循環(huán)。25 μL的反應體系：PreMix 12.5 μL，引物上下游各300 nmol，探針200 nmol，水7.5 μL，模板3 μL。以GAPDH mRNA標準化。

1.6 Western blot 法檢測APJ、eNOS和磷酸化eNOS的蛋白表達

按常規(guī)方法提取蛋白樣品及進行蛋白定量。取蛋白樣品50 μg上樣，12% SDS-PAGE電泳分離蛋白，用半干式電轉移法將蛋白質轉移到PVDF膜上。用含3%脫脂奶粉的封閉液封閉1 h后，加入1∶1000稀釋的APJ、eNOS和ser1177-eNOS一抗，4 ℃孵育過夜，TBST 沖洗3次，加入按1∶5000稀釋的二抗，室溫孵育1 h，用TBST沖洗3次，ECL顯色并曝光于X膠片，用凝膠圖像分析系統(tǒng)進行掃描分析和拍照。

1.7 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)以（均數(shù)±標準差）表示，用one-way ANOVA 作統(tǒng)計學處理，組間比較用Student-Newman-Keuls （SNK）方法檢驗，P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 丹參酮IIA對心肌缺血損傷大鼠血漿和心肌組織apelin含量的影響

ISO致心肌缺血后，ISO組大鼠血漿和心肌組織apelin含量明顯低于正常對照組54.2%和76.1%（P＜ 0.01）。與ISO組比較，中、高劑量丹參酮IIA治療組血漿和心肌組織apelin有明顯升高，血漿apelin分別增加了2.88倍和11.08倍（P＜ 0.01），心肌組織apelin分別增加99.4%和2.52倍（P＜ 0.01）。見圖1。

圖1 丹參酮IIA對心肌缺血損傷大鼠血漿和心肌組織apelin含量的影響

2.2 丹參酮IIA對心肌缺血損傷大鼠血漿和心肌組織NO含量的影響

與正常對照組相比，ISO組大鼠血漿和心肌組織NO含量明顯減少25.6%和74.8%（P＜ 0.01）。給予丹參酮IIA藥物后，高、中劑量治療組血漿和心肌組織NO含量顯著高于ISO組，血漿NO含量分別增加59.5%和1.08倍（P＜ 0.01），心肌組織中NO含量分別增加3.47倍和5.68倍（P＜ 0.01），見圖2。

圖 2 丹參酮IIA對心肌缺血損傷大鼠血漿和心肌組織NO含量的影響

2.3 丹參酮IIA對心肌缺血損傷大鼠組織apelin及其受體APJ mRNA表達的影響

Real-time PCR結果顯示，與正常對照組比較，ISO組大鼠心肌apelin和APJ mRNA的表達水平分別下降77.1%和65.1%（P＜ 0.01）；與ISO組比較，丹參酮IIA 3.0 g·kg-1治療組心肌apelin mRNA的水平明顯升高3.04倍（P＜ 0.01），中、高劑量丹參酮IIA治療組心肌APJ mRNA的水平明顯升高，分別增高了1.01倍和2.46倍（P＜ 0.01），見圖3。

圖3 丹參酮IIA對心肌缺血損傷大鼠組織apelin及其受體APJ mRNA表達的影響

2.4 丹參酮IIA對心肌缺血損傷大鼠心肌組織中APJ、eNOS和磷酸化eNOS的蛋白表達的影響

Western blot結果顯示，心肌缺血損傷大鼠心肌組織中APJ蛋白表達水平明顯低于正常組，并且ser1177-eNOS 水平也有所降低（P＜ 0.01），中、高濃度的丹參酮IIA能逆轉鈣化心肌缺血損傷大鼠心肌組織中的APJ 蛋白表達水平和ser1177-eNOS 水平，結果見圖4。

圖4 丹參酮IIA對心肌缺血損傷大鼠組織APJ、eNOS和ser1177-eNOS的蛋白表達的影響

3 討論

本實驗中，大鼠心肌缺血損傷時，血液和心肌組織中apelin含量明顯降低；心肌組織apelin和APJ mRNA水平顯著下降。有類似研究表明：大劑量異丙腎上腺素所致的心肌缺血損傷大鼠的血漿和心室肌、房前肌中apelin含量顯著降低，心肌中apelin和APJ mRNA表達降低；給予apelin可明顯改善心肌損傷的程度[4]。

本實驗結果顯示，丹參酮IIA在明顯減輕ISO所致的大鼠心肌缺血損傷的同時，血漿和組織apelin含量較ISO組顯著升高，提示丹參酮IIA可能通過影響apelin水平改善缺血心肌血管舒縮功能等作用來抗缺血性心肌損傷。此外，高劑量丹參酮IIA治療組大鼠心肌組織中的apelin含量較ISO組明顯升高，該結果與其mRNA表達增加的結果一致；但是，丹參酮IIA治療組大鼠血漿中apelin含量較心肌組織中升高更明顯，提示除心肌組織外，丹參酮IIA可能還通過其他組織產生apelin，使其血中含量顯著增加。另外，中、高劑量的丹參酮IIA治療組大鼠心肌組織中APJ mRNA水平較ISO組有顯著增高。提示丹參酮IIA可能通過上調大鼠心肌組織中apelin/APJ系統(tǒng)發(fā)揮抗ISO造成的心肌損傷。

Apelin在體內可增加NO的生成。Tatemoto等[5]給麻醉大鼠腹腔內注射apelin，結果提示apelin可能通過eNOS促進NO生成進而降低血壓。Jia等[6]用apelin刺激離體大鼠主動脈，結果大鼠血管NO生成和總NOS活性呈濃度依賴性增加，且以內皮型NOS（eNOS）活性升高為主，進一步證實apelin通過NO途徑擴血管、降血壓。在心血管系統(tǒng)，NO除介導內皮依賴的舒張血管作用外，具有直接淬滅氧自由基，抑制細胞膜脂質過氧化，從而保護心肌細胞等作用[7-8]。本實驗也發(fā)現(xiàn)，丹參酮IIA具有顯著的抗心肌缺血損傷作用，同時血清和心肌組織中NO水平明顯增加，且血液中NO含量甚至高于正常對照組，而且該結果也與血液中apelin含量的顯著升高結果一致。Jia等[6]研究發(fā)現(xiàn)，apelin可濃度依賴性增加大鼠主動脈NO的生成及NOS活性，可濃度依賴性增強動脈組織L-Arg的轉運。

本實驗結果發(fā)現(xiàn)，丹參酮IIA可以使eNOS的磷酸化水平增高，使eNOS的活性增強，NO生成增多。提示apelin通過增加外L-Arg轉運及NOS活性，增加NO的生成，從而引起血管擴張，發(fā)揮降血壓的作用。由此，我們推測，丹參酮IIA抗心肌缺血損傷的機制可能與其顯著增加apelin/APJ表達、增加eNOS的磷酸化和活化水平，進而升高心肌組織和血漿中NO濃度等作用有關。本實驗中發(fā)現(xiàn)丹參酮IIA減輕了ISO造成心肌損傷的發(fā)生發(fā)展，為心肌損傷相關的心血管疾病提供新的靶點，值得深入探討。

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[2] 潘春水，齊永芬，唐朝樞.Apelin 及其生物學效應[J]. 生物科學進展， 2005， 36(3)：223-226.

[3] 鄔浩杰. 丹參的藥理作用研究[J].浙江中醫(yī)藥大學學報，2008，32（5）：694-695.

[4] 賈月霞，曹軍，齊永芬，等. Apelin對異丙腎上腺素誘導的大鼠心肌缺血性損傷的影響[J].中國病理生理雜志，2005，21(12)：2289-2294.

[5] Tatemoto K, Takayama K, Zou MX,et al. The novel peptide apelin lowers blood pressure via a nitric oxide-dependent mechanism[J]. Regul Pept, 2001, 99(2-3): 87-92.

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