趙 雪，吳麗娟，劉毓剛

（1.成都軍區(qū)總醫(yī)院檢驗(yàn)科／成都軍區(qū)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心，成都610083；2.四川省達(dá)州市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科 635000）

外周血雙陰性T細(xì)胞升高與臨床疾病的關(guān)系＊

趙 雪1，2，吳麗娟1△，劉毓剛1

（1.成都軍區(qū)總醫(yī)院檢驗(yàn)科／成都軍區(qū)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心，成都610083；2.四川省達(dá)州市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科 635000）

目的了解外周血雙陰性T細(xì)胞（DNT）含量升高的臨床疾病譜，探討DNT升高的臨床意義。方法回顧性分析2010年1月至2012年2月，收治患者中接受外周血T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)且DNT升高的病歷資料，以臨床診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，按照疾病分類統(tǒng)計(jì)分析。T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)采用流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)技術(shù)。結(jié)果健康人外周血DNT占淋巴細(xì)胞的（7.36±2.13）%，含量達(dá)（0.13±0.06）×109／L。送檢患者中約有5.45%的外周血DNT增高，主要見于肺部細(xì)菌感染、全身性病毒感染、不明原因發(fā)熱、胸膜炎、急性扁桃體炎、創(chuàng)傷、腦膜炎等。DNT在外周血淋巴細(xì)胞中的比例增高和絕對(duì)含量增高均以急性扁桃體炎為最高，不明原因的發(fā)熱次之。增高患者中又以13～17歲青少年患者DNT升幅為最大。結(jié)論外周血DNT主要是在臨床急性炎癥性疾病時(shí)明顯升高，可能參與了急性感染、嚴(yán)重創(chuàng)傷等患者的細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)。

流式細(xì)胞術(shù)；外周血；雙陰性T細(xì)胞；疾病譜

雙陰性 T細(xì)胞（double－negative T－cell，DNT）是淋巴細(xì)胞亞群中的一種，免疫學(xué)標(biāo)志為CD3＋CD4－CD8－，因其細(xì)胞表面沒有CD4、CD8表達(dá)而被稱為雙陰性［1－2］。近年來(lái)，由于多色流式細(xì)胞分析儀的誕生，DNT細(xì)胞的檢測(cè)成為可能。在日常外周血T淋巴細(xì)胞亞群分析中，只要采用CD3－CD4－CD8的三色流式細(xì)胞術(shù)即可從淋巴細(xì)胞群中很容易地將DNT細(xì)胞區(qū)分出來(lái)并加以測(cè)定［3］。本文回顧性分析本院近期外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)中DNT異常升高的患者資料，以明確外周血DNT含量的參考范圍及其異常升高與臨床疾病的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2010年1月至2012年2月，本院臨床送驗(yàn)T細(xì)胞亞群的病例1 780例，DNT細(xì)胞升高97例，其中男72例，女25例，年齡1～77歲，平均28.2歲。對(duì)照組63例，為近期健康體檢被證實(shí)的健康個(gè)體，其中男33例，女30例，年齡15～63歲，平均30.5歲。

1.2 標(biāo)本采集 清晨采集靜脈血2～3mL，乙二胺四乙酸二鉀（EDTA－2K）抗凝（紫頭真空采血管），立即檢驗(yàn)。

1.3 流式T細(xì)胞亞群的檢測(cè) 采用雙平臺(tái)三色熒光全血細(xì)胞直接染色免洗流式測(cè)定法、SSC／FSC設(shè)門淋巴細(xì)胞，分析總T細(xì)胞（CD3＋）、T4細(xì)胞（CD3＋CD4＋CD8－）、T8細(xì)胞（CD3＋CD4－CD8＋）、DNT（CD3＋CD4－CD8－）百分含量和絕對(duì)含量，計(jì)算T4／T8細(xì)胞比值。全部試劑如同型對(duì)照抗體IgG1－FITC／IgG1－PE／IgG1－PC5，測(cè) 定 抗 體 CD4－FITC／CD8－PE／CD3－PC5、標(biāo)本預(yù)處理試劑等均為美國(guó)Beckman－Coulter公司產(chǎn)品，儀器采用Beckman－Coulter XL4－MCL型流式細(xì)胞儀。具體檢測(cè)方法參照文獻(xiàn)［3］進(jìn)行。

1.4 診斷標(biāo)準(zhǔn) 以對(duì)照組DNT細(xì)胞百分含量和絕對(duì)含量的（＋2s）為臨界值，大于該水平即被認(rèn)為增高。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，計(jì)量資料組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 外周血DNT增高的疾病分布 1 780例患者中DNT增高97例，增高率5.45%。97例DNT增高患者中臨床資料齊全的共54例，包括肺部細(xì)菌感染14例（26.4%），全身性病毒感染11例（20.8%），不明原因發(fā)熱6例（11.3%），胸膜炎6例（11.3%），急性扁桃體炎5例（9.4%），創(chuàng)傷3例（5.6%），腦膜炎2例（3.7%），潰瘍性結(jié)腸炎1例（1.9%），退行性脊椎炎1例（1.9%），椎間盤突出1例（1.9%），氣胸1例（1.9%），慢性腎功能不全1例（1.9%），高血壓1例（1.9%），白內(nèi)障1例（1.9%）。2.2 DNT增高患者的外周血DNT水平 DNT在外周血淋巴細(xì)胞中的比例以急性扁桃體炎患者最高，約占淋巴細(xì)胞的1／2；其次是不明原因的發(fā)熱患者，約占淋巴細(xì)胞的1／4；其余依次是肺部細(xì)菌感染、全身性病毒感染、胸膜炎和創(chuàng)傷。DNT絕對(duì)含量以急性扁桃體炎患者最高，其余依次是不明原因的發(fā)熱患者、創(chuàng)傷、肺部細(xì)菌感染、全身性病毒感染、胸膜炎，見表1。

表1 外周血DNT增高患者的流式檢測(cè)結(jié)果（±s）

表1 外周血DNT增高患者的流式檢測(cè)結(jié)果（±s）

a：P＜0.05，b：P＜0.01，與對(duì)照組比較。

組別 n 絕對(duì)含量（×109／L）對(duì)照組63 0.13±0.06肺部細(xì)菌感染組 14 0.27±0.26b全身性病毒感染組 11 0.21±0.15b不明原因發(fā)熱組 6 0.82±1.30b胸膜炎組 6 0.19±0.05a急性扁桃體炎組 5 2.68±1.36b創(chuàng)傷組 3 0.29±0.05a其他疾病組 9 0.25±0.13a

2.3 外周血DNT增高與患者年齡的關(guān)系 將97例外周血DNT增高患者按照年齡進(jìn)行分組。數(shù)據(jù)顯示13～17歲青少年人群DNT升幅最大，DNT平均可增高到占淋巴細(xì)胞的1／3以上，絕對(duì)含量可增加一個(gè)數(shù)量級(jí)，結(jié)果見表2。

表2 不同年齡外周血DNT細(xì)胞含量升高水平（±s）

表2 不同年齡外周血DNT細(xì)胞含量升高水平（±s）

a：P＜0.05，b：P＜0.01，與0～3歲組比較；c：P＜0.05，d：P＜0.01，與4～12歲組比較；e：P＜0.05，f：P＜0.01，與13～17歲組比較。

年齡組 n 絕對(duì)含量（×109／L）0～3歲組 12 0.89±1.01e 4～12歲組 23 0.53±0.59f 13～17歲組 7 2.07±1.79bd 18～60歲組 48 0.24±0.16af＞60組 7 0.18±0.06af

3 討 論

正常情況下，T細(xì)胞占淋巴細(xì)胞總數(shù)的65%以上，是人類最重要的免疫效應(yīng)細(xì)胞。T細(xì)胞（CD3＋淋巴細(xì)胞）包括T4細(xì)胞（CD3＋CD4＋CD8－，也稱 CD4＋T 細(xì)胞）、T8細(xì)胞（CD3＋CD4－CD8＋，也稱CD8＋T細(xì)胞）、DNT（CD3＋CD4－CD8－）和雙陽(yáng)性T細(xì)胞（CD3＋CD4＋CD8＋，簡(jiǎn)稱DPT）等亞群［3－4］。Fischer等［5］采用密度梯度離心法分離了20例健康人的外周血單個(gè)核細(xì)胞，以CD3、CD4、CD8、TCRαβ、TCRγδ熒光標(biāo)記抗體染色，用流式細(xì)胞儀對(duì)其中的DNT進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DNT占CD3＋細(xì)胞的4.1%（1.9%～7.7%）。對(duì)這些DNT的進(jìn)一步鑒定證實(shí)，健康人外周血中的DNT細(xì)胞主要表達(dá)TCRγδ（平均3.2%，范圍2.1%～3.6%），TCRαβ＋的 DNT細(xì)胞僅占0.9%（0.4%～1.9%）。上述結(jié)果表明，健康人外周血中是存在一定數(shù)量的DNT細(xì)胞的。本實(shí)驗(yàn)室2005年采用全血細(xì)胞直接染色免洗流式測(cè)定法，對(duì)200例健康人進(jìn)行了外周血DNT含量調(diào)查，結(jié)果顯示健康人外周血中DNT的百分含量占淋巴細(xì)胞的12.33%以內(nèi)，絕對(duì)含量達(dá)到（0.24～1.08）×109／L水平［3］。之后立即在流式細(xì)胞術(shù)外周血T細(xì)胞亞群檢測(cè)中向臨床回報(bào)DNT百分含量和絕對(duì)含量檢測(cè)結(jié)果。本研究對(duì)本院近一段時(shí)間臨床標(biāo)本中DNT含量增高的患者進(jìn)行了調(diào)查分析，同樣證實(shí)健康人外周血中含有（7.36±2.13）%、（0.13±0.06）×109／L的 DNT；發(fā)現(xiàn)在臨床送驗(yàn)的各種疾病患者的外周血樣中大約有5.45%的患者存在DNT增高的情況，其中主要是肺部細(xì)菌感染、全身性病毒感染、不明原因發(fā)熱、胸膜炎、急性扁桃體炎等；急性扁桃體炎時(shí)，外周血DNT甚至可以占到淋巴細(xì)胞的一半以上，每升全血中的DNT含量可以達(dá)到109水平；并且發(fā)現(xiàn)在13～17歲年齡階段的患者，其DNT增高的幅度最大。本研究與Fischer K等［5］的報(bào)道在數(shù)值上存在一定差異，這可能與采取的方法以及觀察對(duì)象人種不同有關(guān)。采用傳統(tǒng)方法在單個(gè)核細(xì)胞提取時(shí)可能造成部分DNT丟失，而染色后的洗滌過(guò)程可能引起熒光抗體的部分脫落，導(dǎo)致檢驗(yàn)結(jié)果偏低。因此，筆者推薦外周血淋巴細(xì)胞亞群分析應(yīng)盡量采取新一代全血細(xì)胞直接染色免洗流式測(cè)定法，其檢測(cè)結(jié)果更為準(zhǔn)確。

外周血DNT細(xì)胞的來(lái)源目前尚不清楚。有學(xué)者以鼠為動(dòng)物模型研究提示，DNT可能來(lái)自CD8＋T細(xì)胞的前體細(xì)胞［6］，但是 MacDonald［7］則認(rèn)為 DNT 細(xì)胞有自己獨(dú)特的分化途徑并非依賴CD8＋細(xì)胞，肯定存在一種胸腺分化外途徑。Zhang等［8］發(fā)現(xiàn)存在αβ－TCR＋、CD3＋、CD4－、CD8－、CD25＋、CD28－、CD44－、NK1.1－這樣一群獨(dú)特的DNT細(xì)胞，也提示可能存在胸腺以外的形成途徑。

在功能方面，目前已證實(shí)DNT細(xì)胞能夠抑制具有相同T細(xì)胞受體的CD8＋T細(xì)胞和CD4＋T細(xì)胞的功能［1］。Strober等［9］首次發(fā)現(xiàn)αβ－TCR＋雙陰性NKT細(xì)胞具有抑制功能并誘導(dǎo)免疫耐受，隨后Johansson等［10］在轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)分離出無(wú)反應(yīng)性的NK1.1－DN T細(xì)胞。也有學(xué)者報(bào)道人類DNT細(xì)胞具有一定的抑制性免疫調(diào)節(jié)功能［11］。本研究顯示，外周血DNT升高主要見于臨床炎癥性疾病，包括感染性和非感染性疾病，結(jié)合上述國(guó)外研究成果，筆者推測(cè)炎癥性疾病時(shí)外周血DNT增高可能參與了對(duì)體內(nèi)T4、T8細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)，通過(guò)對(duì)過(guò)高T4或T8細(xì)胞應(yīng)答的抑制來(lái)預(yù)防體內(nèi)細(xì)胞免疫應(yīng)答的過(guò)度亢進(jìn)，防止過(guò)度免疫反應(yīng)對(duì)機(jī)體造成免疫損傷?；谏鲜鐾茰y(cè)，筆者認(rèn)為青少年患者外周血DNT細(xì)胞增高的幅度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他年齡段患者的情況，是因?yàn)榍嗌倌耆巳篢細(xì)胞發(fā)育已經(jīng)完全成熟，且T細(xì)胞的功能正值旺盛時(shí)期，機(jī)體遭遇外來(lái)抗原刺激時(shí)其反應(yīng)性強(qiáng)于低齡段和高齡段人群的T細(xì)胞，因此需要更多的DNT細(xì)胞來(lái)平衡強(qiáng)烈的T細(xì)胞應(yīng)答。

因此，檢測(cè)外周血DNT十分重要，它是急性感染、嚴(yán)重創(chuàng)傷等患者體內(nèi)的免疫功能狀態(tài)、病情監(jiān)測(cè)的一個(gè)新指標(biāo)。進(jìn)一步開展有關(guān)外周血DNT來(lái)源、特性、功能、表達(dá)及激活機(jī)制的研究，或許能探索出一條嶄新的臨床治療路徑，推動(dòng)未來(lái)相關(guān)疾病的免疫治療。

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The relationship between the increase of double negative T cell in peripheral blood and clinical disease＊

Zhao Xue1，2，Wu Lijuan1△，Liu Yugang1
（1.Department of Medical Laboratory，Chengdu Military General Hospital，Chengdu，Sichuan610083，China；2.Department of Medical Laboratory，Dazhou Central Hospital，Dazhou，Sichuan635000，China）

ObjectiveTo analyze the clinical spectrums of disease of abnormal elevation of double negative T cells in peripheral blood，and identify the clinical significance of double negative T cells（DNT）increase.MethodsWe did a retrospective analysis of the medical data of patients who were DNT increased in peripheral blood obtained from January 2010to February 2012.Our research set clinical diagnosis as gold standard and we conducted the statistical analysis in accordance with the classification of diseases.T lymphocyte subsets were assessed by flow cytometry.ResultsThe DNT percentage and absolute quantity was（7.36±2.13）%and（0.13±0.06）×109／L in healthy people.There were about 5.45%patients had an increased DNT levels in all delivered T cell subset examination patients.DNT increasing in peripheral blood mainly found in pneumonic bacterial infection，general viral infection，innubibus fever，pleuritis，acute tonsillitis，trauma and cephalomeningitis，etc.Acute tonsillitis patients had the highest percentage and absolute quantity increase of DNT，followed by innubibus fever.In addition，adolescents aged 13to 17had the highest increase of DNT.ConclusionDNT were significantly increased in peripheral blood of acute inflammation patients，and it maybe take part in regulating cell immunity in patients with acute infection，severe trauma，etc.

flow cytometry；peripheral blood；double negative T cell；disease spectrum

10.3969／j.issn.1671－8348.2012.35.006

A

1671－8348（2012）35－3702－02

四川省科技廳基金資助項(xiàng)目（2011JY0037）。 △

，Tel：（028）86571052；E－mail：wulijuan1638＠126.com。

2012－06－09

2012－08－22）

·臨床研究·