劉 英，姚開泰，肖廣惠

（南方醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所，廣州510515）

人肺腺癌吉非替尼耐藥細(xì)胞系A(chǔ)549／GR的建立及小白菊內(nèi)酯逆轉(zhuǎn)耐藥機制研究＊

劉 英，姚開泰，肖廣惠△

（南方醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所，廣州510515）

目的建立人肺腺癌吉非替尼耐藥細(xì)胞系A(chǔ)549／GR，研究其耐藥機制，探討小白菊內(nèi)酯（PAR）逆轉(zhuǎn)A549／GR耐藥的機制。方法以吉非替尼為誘導(dǎo)劑，人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549為誘導(dǎo)對象，采用大劑量沖擊和逐步增加劑量相結(jié)合的方法，誘導(dǎo)建立人肺腺癌吉非替尼耐藥細(xì)胞系A(chǔ)549／GR。采用細(xì)胞毒實驗（MTT）法測定細(xì)胞耐藥指數(shù)，免疫印跡法（Western blotting）檢測細(xì)胞耐藥相關(guān)蛋白表達水平，進一步通過MTT法檢測PAR對A549／GR的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)，Annexin V－FITC雙標(biāo)法檢測PAR的促凋亡作用，Western blotting檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達水平。結(jié)果所建立的人肺腺癌吉非替尼耐藥細(xì)胞系A(chǔ)549／GR耐藥指數(shù)為18.7。A549／GR細(xì)胞中MDR和ABCG2耐藥相關(guān)蛋白表達水平較A549升高。MTT結(jié)果顯示PAR對耐藥細(xì)胞A549／GR的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為8.66。Annexin V－FITC凋亡檢測結(jié)果顯示PAR能有效促進A549／GR細(xì)胞凋亡，Western blotting檢測顯示PAR能有效降低survivin、Bcl－2兩種抑制凋亡相關(guān)蛋白的表達。結(jié)論成功建立了人肺腺癌吉非替尼耐藥細(xì)胞系A(chǔ)549／GR；PAR通過促進A549／GR細(xì)胞凋亡有效逆轉(zhuǎn)其耐藥。

肺腫瘤；抗藥性；細(xì)胞凋亡；逆轉(zhuǎn)劑；靶向治療

肺癌是最常見的肺原發(fā)性惡性腫瘤，近年來，肺癌的發(fā)病率和病死率均迅速上升。肺癌的治療方案是以手術(shù)為主的綜合治療，隨著靶向藥物的問世，使肺癌的治療向前邁進了一大步。靶向藥物是目前最先進的用于治療惡性腫瘤的藥物，它通過與癌癥發(fā)生、發(fā)展所必需的特定分子靶點的作用來阻止癌細(xì)胞的生長。故靶向藥物以其高特異性、低細(xì)胞毒性的特點，逐漸成為臨床腫瘤治療的首選藥物［1－2］。吉非替尼（gefitinib，商品名Iressa）是一種選擇性表皮生長因子受體（EGFR）酪氨酸激酶抑制劑，2003年被美國食品藥品管理局（FDA）批準(zhǔn)作為非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的三線治療藥物，主要用于治療既往接受過化學(xué)治療的局部晚期或轉(zhuǎn)移性NSCLC［3－4］。然而在用藥過程中出現(xiàn)吉非替尼耐藥使得肺癌治療再次陷入困境，為此尋找高效、低毒的逆轉(zhuǎn)劑逆轉(zhuǎn)腫瘤治療過程中出現(xiàn)的多藥耐藥已是一個重要研究方向。

研究發(fā)現(xiàn)，許多天然植物成分能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，并能使腫瘤細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞周期阻滯，抑制其增殖。小白菊內(nèi)酯（parthenolide，PAR）是從菊科植物野甘菊中提取的一種倍半萜內(nèi)酯化合物，西方國家曾主要用于治療皮膚感染、風(fēng)濕病和偏頭疼。近年來，發(fā)現(xiàn)PAR具有多種生物活性，并且對多種腫瘤株有抑制作用。本研究通過體外實驗檢測PAR能否逆轉(zhuǎn)人肺癌吉非替尼耐藥細(xì)胞A549／GR的耐藥性，并探討其逆轉(zhuǎn)耐藥的機制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 吉非替尼，阿斯利康公司產(chǎn)品，劑型：250毫克／片；PAR、二甲基四氮唑藍（MTT）和二甲基亞砜（DMSO）均為Sigma公司產(chǎn)品。PRMI1640完全培養(yǎng)液、胎牛血清和胰蛋白酶為 Hyclone公司產(chǎn)品?？贵w MDR、ABCG2、survivin、Bcl－2和內(nèi)參磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體均為Sanata Cruz公司產(chǎn)品。Annexin V－FITC凋亡試劑盒為Key GEN公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞系、細(xì)胞培養(yǎng)及耐藥細(xì)胞誘導(dǎo)方法 人肺腺癌細(xì)胞株A549為南方醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所保存、復(fù)蘇傳代所得。用含10%胎牛血清和青霉素、鏈霉素各100U／mL的1640培養(yǎng)基，置于37℃5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。0.25%胰蛋白酶消化傳代。取對數(shù)生長期的細(xì)胞進行實驗。耐藥細(xì)胞采用大劑量沖擊和逐漸增加劑量相結(jié)合的方法誘導(dǎo)產(chǎn)生［5－6］。先用細(xì)胞毒實驗（MTT）法測定吉非替尼對敏感細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）為1.88μmol／L，然后用含18μmol／L吉非替尼的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，立即更換含半數(shù)抑制濃度吉非替尼的培養(yǎng)基培養(yǎng)5～10d，直至細(xì)胞穩(wěn)定生長并傳代3次，再次測定IC50。然后再次用含18μmol／L吉非替尼的培養(yǎng)基培養(yǎng)沖擊24h，更換吉非替尼半數(shù)抑制濃度漸次提高了的培養(yǎng)基。直至細(xì)胞在含有18μmol／L吉非替尼的培養(yǎng)基中穩(wěn)定生長并連續(xù)傳代3次，最后測定吉非替尼的IC50為35.10μmol／L，命名為A549／GR。

1.2.2 MTT法 實驗前將A549／GR細(xì)胞傳代，在不含吉非替尼的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至少7d。選取對數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105／mL，加入96孔板，每孔100μL。置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞完全貼壁。次日換液后再分別加入100μL呈半數(shù)藥物濃度梯度的培養(yǎng)基，每孔總體積為200μL，共設(shè)置7個濃度梯度，1個空白對照，各種藥物濃度做3個平行孔。培養(yǎng)72h后，每孔加入5mg／mL的MTT 20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸出培養(yǎng)基，每孔加入DMSO 150 μL，輕微振蕩10min溶解結(jié)晶。以490nm為檢測波長，在酶標(biāo)儀上檢測各孔的吸光度（A）值，細(xì)胞存活率＝（實驗組A值／對照組A值）×100%，計算IC50值。耐藥倍數(shù)＝耐藥細(xì)胞IC50／親代細(xì)胞IC50，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)＝使用逆轉(zhuǎn)劑前IC50／使用逆轉(zhuǎn)劑后IC50。MTT實驗在不同日重復(fù)3次。

1.2.3 細(xì)胞凋亡檢測 將生長狀態(tài)良好的A549／GR細(xì)胞分別設(shè)置對照組和PAR處理組兩組，加藥作用72h后，用不含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶消化收集細(xì)胞團塊。用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次（2 000r／min離心5min）收集（1～5）×105個細(xì)胞；加入500μL的Binding緩沖液懸浮細(xì)胞；加入5μL Annexin V－FITC混勻后，加入5μL碘化丙啶（PI），混勻；室溫，避光、反應(yīng)5～15min；在1h內(nèi)進行流式細(xì)胞儀的觀察和檢測，收集圖片并進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 蛋白提取和免疫印跡法（Western blotting）檢測 用冰預(yù)冷的RIPA 細(xì)胞裂解液（50mmol／L Trison HCl pH 7.4，150mmol／L NaCl，1%Triton X－100，1%sodium deoxycholate，0.1%SDS，1mmol／L EDTA，1mmol／L PMSF）分別裂解A549、A549／GR（對照組、單藥吉非替尼組及PAR聯(lián)合吉非替尼組）共4組細(xì)胞，離心收集上清。BCA法測定蛋白濃度。取20μg蛋白上樣，經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）后轉(zhuǎn)膜，室溫封閉90min，加入一抗（Mdr，1∶500；ABCG2，1∶500；survivin，1∶500；Bcl－2，1∶500；GAPDH，1∶1 000），4℃過夜；洗膜緩沖液（TBST）洗膜5 min，3次后加入二抗（1∶1 000）室溫孵育90min，用TBST洗膜5min，3次，ECL化學(xué)發(fā)光顯色，由Bio RAD凝膠成像儀攝取凝膠圖像，用Quantity One軟件進行吸光度分析，實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進行描述性統(tǒng)計分析。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞耐藥指數(shù)檢測 通過大劑量沖擊和逐步增加劑量相結(jié)合的方法，歷時8個月建立了吉非替尼的耐藥細(xì)胞系，命名為A549／GR，以細(xì)胞存活率為縱坐標(biāo)、吉非替尼濃度為橫坐標(biāo)作圖（圖1）。可見在相同吉非替尼濃度下，A549／GR的存活率高于A549，吉非替尼對兩細(xì)胞的IC50分別為35.10μmol／L（A549／GR）和1.88μmol／L（A549），耐藥指數(shù)為18.7。

圖1 A549／GR細(xì)胞的耐藥性檢測

2.2 耐藥相關(guān)蛋白的檢測 Western blotting檢測耐藥相關(guān)蛋白，結(jié)果顯示與親代細(xì)胞A549對比，耐藥細(xì)胞A549／GR中MDR和ABCG2兩種耐藥相關(guān)蛋白都明顯升高，見圖2。

圖2 Western blotting檢測A549和A549／GR細(xì)胞中MDR和ABCG2蛋白表達水平

2.3 PAR體外逆轉(zhuǎn)耐藥實驗 聯(lián)合低劑量PAR（20μmol／L）用藥可明顯降低吉非替尼對A549／GR半數(shù)抑制濃度，以細(xì)胞存活率為縱坐標(biāo)、吉非替尼濃度為橫坐標(biāo)作圖（圖3）。聯(lián)合應(yīng)用PAR前后吉非替尼對A549／GR的IC50分別為35.10μmol／L吉非替尼單藥組和4.05μmol／L吉非替尼聯(lián)合PAR用藥組），其逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為8.66。

圖3 PAR逆轉(zhuǎn)A549／GR耐藥實驗

2.4 PAR逆轉(zhuǎn)耐藥機制的探討 Annexin V－FITC凋亡檢測結(jié)果顯示，低劑量PAR（20μmol／L）作用于A549／GR可以有效誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡（圖4）。同時 Western blotting檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，低劑量PAR及聯(lián)合吉非替尼用藥組細(xì)胞中，survivin、Bcl－2兩種抑制凋亡相關(guān)蛋白都明顯降低，且聯(lián)合用藥降低更明顯，見圖5。

圖4 A549／GR細(xì)胞凋亡分析

圖5 Western blotting檢測蛋白survivin及Bcl－2的表達水平

3 討 論

當(dāng)腫瘤對一種抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥性的同時，對結(jié)構(gòu)和作用機制不同的其他抗腫瘤藥物也產(chǎn)生交叉耐藥性，通常稱之為多藥耐藥性（multi－drug resistance，MDR），早在1970年 Biedler等［7］就首次報道腫瘤存在MDR現(xiàn)象。在對腫瘤MDR現(xiàn)象的研究過程中發(fā)現(xiàn)，有些腫瘤經(jīng)誘導(dǎo)才會產(chǎn)生耐藥性，即在首次用藥或前幾個療程是敏感的，到后來才逐漸耐藥，這種稱之為獲得性耐藥即后天耐藥。在臨床腫瘤患者中，絕大多數(shù)是屬于獲得性耐藥，即一開始是對治療敏感的，但是用藥治療幾個周期后，腫瘤開始對藥物耐受并出現(xiàn)復(fù)發(fā)或者轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。采用大劑量沖擊和逐步增加藥物劑量相結(jié)合的方法誘導(dǎo)產(chǎn)生的耐藥細(xì)胞株，這與臨床上腫瘤患者出現(xiàn)耐藥的機制類似，更有研究價值。故本課題采用大劑量沖擊和逐步增加藥物劑量相結(jié)合的方法歷時8個月，成功誘導(dǎo)建立人非小細(xì)胞肺癌吉非替尼耐藥細(xì)胞系A(chǔ)549／GR，通過MTT實驗證實該耐藥細(xì)胞系的耐藥指數(shù)高達18.7。

關(guān)于MDR的產(chǎn)生已經(jīng)提出幾種較為肯定的機制，其中最為重要的機制被認(rèn)為是細(xì)胞膜上存在一種P－糖蛋白（P－glycoprotein，P－gp）引起，1976年Juliano等［8］在耐藥的中國倉鼠卵巢癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)一種相對分子質(zhì)量為1.7×105的糖蛋白，被命名P－gp，它是多藥耐藥基因 MDR1基因編碼的產(chǎn)物［9］。P－gp能將細(xì)胞內(nèi)的化療藥物泵出胞外，從而降低細(xì)胞內(nèi)的有效藥物濃度產(chǎn)生耐藥，呈現(xiàn)典型的MDR表型。ABCG2是ABC轉(zhuǎn)運體超家族的成員之一。ABC轉(zhuǎn)運體的表達是腫瘤細(xì)胞對化療藥物耐受的一個重要機制，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)3個人類的ABC轉(zhuǎn)運體與多藥耐藥相關(guān)，這3個轉(zhuǎn)運體是P－gp、MRP1（multidrug resistance protein 1）和ABCG2。這3個轉(zhuǎn)運體的轉(zhuǎn)運底物特異性很廣，而且在一定程度上重疊，能夠轉(zhuǎn)運當(dāng)前癌癥化療中的主要藥物［10］。本研究建立的人肺腺癌吉非替尼耐藥細(xì)胞A549／GR中MDR、ABCG2耐藥相關(guān)蛋白，表達較親代細(xì)胞A549明顯升高，這可能是A549／GR產(chǎn)生耐藥的主要機制。

肺癌是嚴(yán)重威脅人類生命健康的惡性腫瘤之一，在治療過程中出現(xiàn)的多藥耐藥現(xiàn)象使得肺癌對化療和靶向治療不敏感，從而導(dǎo)致治療效果不理想、病死率高。因此，逆轉(zhuǎn)人肺癌多藥耐藥性是提高肺癌療效的有力手段。目前，逆轉(zhuǎn)劑主要有Ca2＋通道拮抗劑（如維拉帕米）及其衍生物、免疫調(diào)節(jié)劑（如環(huán)孢菌素A）、抗雌激素類（如三苯氧胺）等，但這些藥物因其固有的藥理作用而限制了臨床應(yīng)用，因此，研究篩選高效低毒的MDR逆轉(zhuǎn)劑，是提高惡性腫瘤療效的重要途徑。已有研究證明，PAR能促進細(xì)胞毒藥物順鉑對肝癌細(xì)胞HepG2凋亡，二者聯(lián)合具有協(xié)同作用［11］。亦有研究表明PAR通過促進胃癌細(xì)胞SGC7901凋亡達到抗腫瘤作用［12］。本研究針對自主誘導(dǎo)產(chǎn)生的人肺腺癌吉非替尼耐藥細(xì)胞系A(chǔ)549／GR，MTT實驗結(jié)果顯示，聯(lián)合低劑量PAR（20μmol／L）應(yīng)用后，吉非替尼對A549／GR的IC50較單獨應(yīng)用吉非替尼組IC50明顯降低，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)高達8.66，從而證實PAR能有效逆轉(zhuǎn)人A549／GR耐藥作用。而且對比第一、二代逆轉(zhuǎn)劑，PAR具有高效低毒的特點，從而突破前幾代逆轉(zhuǎn)劑不良反應(yīng)太大而限制其臨床應(yīng)用的局限性。AnnexinV－FITC雙標(biāo)凋亡檢測顯示低劑量PAR可有效誘導(dǎo)A549／GR細(xì)胞凋亡，同時Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)PAR可降低凋亡抑制蛋白survivin和Bcl－2表達，結(jié)果表明PAR逆轉(zhuǎn)A549／GR可能的耐藥機制是通過降低凋亡抑制蛋白表達進而促進耐藥細(xì)胞凋亡實現(xiàn)的，至于PAR是否存在其他逆轉(zhuǎn)耐藥有關(guān)的機制還有待進一步研究。

本研究成功建立穩(wěn)定的人肺腺癌吉非替尼耐藥細(xì)胞系A(chǔ)549／GR，并尋找到一種高效、低毒的逆轉(zhuǎn)劑PAR逆轉(zhuǎn)細(xì)胞耐藥，為解決肺癌患者MDR問題提供了一個可能的新途徑。

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Establishment of the gefitinib－resistant A549／GR cell line of humam lung adenocarcinoma and investigation of the mechanism of parthenolide in reversing drug resistance＊

Liu Ying，Yao Kaitai，Xiao Guanghui△
（Cancer Research Institute，Southern Medical University，Guangzhou，Guangdong510515，China）

ObjectiveTo establish a gefitinib resistant cell line A549／GR of human lung adenocarcinoma and investigate the mechanism of drug resistance.Then，to find a reversal agent parthenolide to reverse A549／GR drug resistance.MethodsThe gefitinib resistant cell line A549／GR was established by a method of repeated treatment with high dose of gefitinib for a short period and followed by low but gradually increasing concentrations of the drug.The drug resistance index was determined by MTT assay，and the expression levels of drug resistant related protein MDR and ABCG2were detected by the Western blotting assay.The reversal factor of parthnolide in A549／GR cells was measured by MTT assays.The cell apoptosis was detected by AnnexinV FITC staining and the apoptosis related proteins surviving and Bcl－2were detected by Western blotting analysis.ResultsThe resistance index of A549／GR to gefitinib was 18.7.The expression levels of the drug resistance－related protein MDR and ABCG2were obviously increased in A549／GR cells.Parthenolide effectively reversed drug resistance of A549／GR，with a reversal factor 8.66.Importantly，parthenolide potently induced A549／GR cell apoptosis and inhibited expression of anti－apoptotic protein surviving and Bcl－2.ConclusionA drug－resistant cell line A549／GR expressing typical drug－resistant proteins was established.Parthenolide can reverse the drug－resistant cells by inducing apoptosis of A549／GR cells.

lung neoplasms；drug resistance；apoptosis；revesal agent；targeted therapy

10.3969／j.issn.1671－8348.2012.35.001

A

1671－8348（2012）35－3689－03

國家重點基礎(chǔ)發(fā)展計劃（973計劃）項目（2010CB529401）。 △

，Tel：2062789442；E－mail：shaxiaohh＠hotmail.com。

2012－06－09

2012－08－22）

·論 著·