李 靜，夏 羽，袁蘇婭，徐金霞，卿素珠

（西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院，陜西楊凌712100）

附睪作為雄性動物生殖器官的一個重要部分，是精子成熟、運輸和儲存的重要部位。附睪上皮細胞的吸收、分泌等功能使精子發(fā)生了一系列結(jié)構、生化和功能的改變，從而使精子成熟，獲得受精和運動能力。研究表明，附睪上皮細胞間的緊密連接形成了精子成熟所必須的附睪腔微環(huán)境，是構成血－附睪屏障的結(jié)構基礎［1－3］。血－睪屏障的存在限制了血液和附睪腔之間的分子運動，維持了腔內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，以利于精子的成熟和儲存。而上皮細胞的極性對于其上皮屏障功能和緊密連接形成等進程是必須的，上皮細胞的極性建立和維持主要受3種蛋白復合體的調(diào)控，即Par（Par3－Par6－aPKC）復合物、Crb（Crb－Pals－PATJ）復合物和Scribble（Lgl－Dlg－Scrib）復合物，Par－aPKC和Crumbs（Crb）復合物負責上皮細胞頂端區(qū)域形成，Scribble復合物負責基底部區(qū)域的形成，三者共同配合發(fā)揮功能［4－6］。在果蠅中只有一種Crb基因，而在人和小鼠中已確定存在Crb1、Crb2和Crb3 3個基因［7］。Crb1主要在人和小鼠的視網(wǎng)膜及大腦的部分區(qū)域表達；Crb2在腎和視網(wǎng)膜高水平表達，而在心臟、肺、胎盤中呈低水平表達；Crb3在視網(wǎng)膜和上皮組織中表達，并在骨骼肌和大腦有微弱的存在［7－8］。Crb3是一種小的跨膜蛋白，由120個氨基酸構成［9］，較多的研究結(jié)果顯示Crb3是一種重要的頂端決定因子［10－11］，而且Crb3與鳥苷酸激酶Palsl、Patj相互作用，共同存在于緊密連接中，起到調(diào)節(jié)細胞緊密連接和維持上皮極性的作用［12－13］。在對斑馬魚ome及相關Crb基因和 MDCK細胞培養(yǎng)［14－15］研究下發(fā)現(xiàn)敲除Crb3將導致多核表型、紡錘體、纖毛及中心體異常，說明Crb3對細胞游離面的纖毛形成也起著重要作用。

目前，有關哺乳動物附睪的形態(tài)學研究已有資料報道［16－18］，但有關附睪組織發(fā)育進程中Crb3的定位及分布規(guī)律尚未見研究報道，因此本研究對Crb3在小鼠生后不同發(fā)育階段附睪組織中的分布定位進行研究，明確其在附睪管道上皮發(fā)育過程中的表達規(guī)律，為進一步了解Crb3在附睪生殖生理中的功能意義提供形態(tài)學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 3周齡、7周齡昆白系健康雄性小鼠購于第四軍醫(yī)大學實驗動物中心。在室溫22℃、控光條件下（14 h光照，10 h黑暗）按常規(guī)方式單籠飼養(yǎng)，購買后至少在實驗室適應環(huán)境1周后用于試驗。分別選取4周齡、8周齡、12周齡、16周齡小鼠用于試驗。每周齡4只，3周至5周小鼠的體重在15 g～20 g，8周至16周小鼠體重在25 g～35 g。

1.1.2 主要儀器設備和試劑 DMIRB型熒光相差倒置顯微鏡，Leica RM2235型石蠟切片機，徠卡儀器設備公司產(chǎn)品；Motic數(shù)碼顯微鏡，廈門麥克奧迪實業(yè)公司產(chǎn)品；GTK－2002自動恒溫攤烤烘片機。主要試劑包括羊抗鼠Crb3（1∶100），Santa Cruz公司產(chǎn)品；Dy Light 488兔抗羊IgG（1∶250），EarthOx公司產(chǎn)品；檸檬酸鹽抗原修復液和免疫熒光封閉液，福州邁新生物技術開發(fā)有限公司產(chǎn)品；DAPI染色劑，Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集、石蠟切片制備及染色 脫頸處死不同周齡的小鼠，取出附睪組織，固定于40 mL／L多聚甲醛。按照常規(guī)方法對固定好的附睪組織進行脫水、透明、浸蠟和包埋處理，連續(xù)切片，片厚5μm，裱片于多聚賴氨酸處理的載玻片上，共制得3套切片，其中1套按常規(guī)HE染色，以確定附睪發(fā)育的組織學特點和陽性產(chǎn)物反應定位；1套切片行Crb3免疫熒光組織化學染色；1套用于陰性對照，以確定本試驗免疫反應的特異性。

1.2.2 免疫熒光組織化學染色程序 切片經(jīng)脫蠟至水，蒸餾水浸泡2 min，PBS 5 min×3；檸檬酸抗原緩沖液微波修復、冷卻至室溫，PBS 5 min×3；室溫封閉2 h，PBS洗5 min×3；一抗1∶100（羊抗鼠Crb3）4℃過夜孵育，PBS洗5 min×5，二抗1∶250（Dy Light 488兔抗羊IgG）室溫避光孵育2 h，PBS洗5 min×5；DAPI避光染核約3 min～5 min，PBS洗5 min×5；抗熒光淬滅封片劑封片；DMIRB型熒光相差倒置顯微鏡下觀察并照相。

2 結(jié)果

2.1 小鼠附睪發(fā)育的組織學特點

光鏡下可見各周齡小鼠附睪外包結(jié)締組織被膜，可見多個發(fā)育狀態(tài)不同的附睪管，管壁外可見肌樣上皮，具體結(jié)構如下：

生后4周，附睪管壁較厚，上皮為2層～3層的假復層纖毛柱狀細胞，可見柱狀細胞頂端明顯的細長纖毛，管腔小而規(guī)則（圖1A）；6周齡附睪管管壁上皮細胞層數(shù)減少至1層～2層，上皮細胞嗜酸性增強，頂端纖毛細長；管腔明顯增大，腔內(nèi)可見少量的精子；管壁外層可見薄層平滑肌環(huán)繞，管之間有密集的結(jié)締組織分布；8周齡附睪管上皮厚度增至最大，上皮細胞呈單層高柱狀，管腔進一步擴大，腔內(nèi)精子數(shù)量增多（圖1B）；12周齡附睪管上皮開始變薄，呈單層柱狀，管腔繼續(xù)增大，內(nèi)含數(shù)量較多精子，管之間結(jié)締組織變得致密（圖1C）；16周齡附睪上皮繼續(xù)變薄，頂部纖毛清晰，管腔變得更大、內(nèi)含大量附睪分泌物及精子，管之間間隙增大、結(jié)締組織稀疏（圖1D）。

圖1 不同周齡小鼠附睪的組織學結(jié)構（400×）Fig.1 Histological structure of mouse epididymis at different weeks of age（400×）

2.2 小鼠附睪組織發(fā)育過程中Crb3的表達規(guī)律

經(jīng)免疫熒光染色后，Crb3陽性反應呈綠色熒光，細胞核被DAPI染為藍色。在檢測的各周齡小鼠附睪管上皮細胞胞膜上均可檢測到陽性信號，陽性產(chǎn)物主要圍繞各細胞的胞膜分布形成明顯的環(huán)狀，陽性產(chǎn)物分布隨附睪發(fā)育進程呈現(xiàn)低－高－低－高的趨勢：第4周出現(xiàn)Crb3的較弱表達，第6周陽性產(chǎn)物分布有所增強，至第8周分布達到最強；而后又開始減弱至16周又逐漸增強；另外，在12周和16周的附睪管腔中的精子尾部斷面也可檢測到微弱的陽性信號。

圖2 Crb3在不同發(fā)育時期小鼠附睪的表達（400×）Fig.2 The expression of Crb3 in different stages of mouse epididymis（400×）

3 討論

王建禮等［16］的研究表明，出生1 d的棕色田鼠可見管腔較大、管壁很薄的附睪管；隨著發(fā)育，管腔由小增大，管壁則先增厚、然后逐級變薄。徐邦生則認為出生1 d的小鼠附睪中無明顯的附睪管；隨著發(fā)育，附睪管直徑不斷增大，上皮由厚變?。?7］。本實驗結(jié)果表明，4周齡時，附睪管柱狀細胞游離面的纖毛已明顯可見，8周齡時附睪管腔內(nèi)已有少量的精子，12周齡后附睪腔里的精子明顯增多；上皮在4周齡時為假復層纖毛柱狀，8周后又演變?yōu)閱螌又鶢睢Ｒ呀?jīng)證實，纖毛可與覆蓋其上的帶有負電荷的糖蛋白構成一道免疫屏障［18］，可以阻止精子抗原的通過，并且可清除精子細胞脫落的胞漿，小滴或衰老、發(fā)育不良的精子，還可增加管腔內(nèi)附睪上皮細胞的面積，有利于精子在附睪內(nèi)環(huán)境中進行物質(zhì)和液體的交換，結(jié)合本研究結(jié)果提示小鼠附睪從4周齡時開始進入青春期，8周齡時已具備成年小鼠的基本特征；隨著小鼠的生長發(fā)育，附睪管的直徑不斷增加，管腔也在逐漸增大，并且腔內(nèi)附睪分泌物與精子密度也是越來越大，而附睪上皮的厚度在8周齡時達到最厚，12周后逐漸變薄，這與徐邦生等的研究結(jié)果基本一致。

本研究在各周齡小鼠附睪管上皮細胞胞膜均檢測到Crb3的陽性信號，陽性產(chǎn)物圍繞各細胞的胞膜分布形成明顯的環(huán)狀，這一結(jié)果更加驗證了Crb3主要存在于頂膜部位，是一種重要的頂端決定因子，主要在具有上皮源性的組織和細胞中表達，對上皮細胞的極性建立和維持發(fā)揮重要作用。并且，Crb3在第8周時附睪管上皮細胞的陽性信號最強，這可能與附睪管腔在此時較小、上皮厚度較厚，承受的壓力較大，因而上皮需要大量的緊密連接有關［1］。資料顯示［3］，附睪上皮主細胞間的緊密連接構成了血－附睪屏障，它能有效組織大分子物質(zhì)如精子抗原物質(zhì)、血清蛋白等的交流，為精子成熟、獲能所依賴的附睪腔提供了穩(wěn)定的環(huán)境；各周齡小鼠附睪管上皮細胞胞膜呈Crb3陽性表達，說明Crb3可能參與血附睪屏障的形成。此外，在附睪發(fā)育后期的精子尾部也檢測到Crb3的微弱陽性信號，精子尾部主要有鞭毛組成，其與纖毛的結(jié)構相同，而研究已經(jīng)表明Crb3對纖毛的形成起著重要作用［14－15］；結(jié)合本研究觀察到的精子鞭毛有Crb3的表達，提示其對精子活力有一定影響。但有關Crb3是如何調(diào)控附睪管上皮細胞極性建立和維持、參與血－附睪屏障形成以及怎樣影響精子成熟，尚需進一步研究。

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