趙永坤，楊艷玲，孫春暉，郎需龍，王秀然，王景龍，張 瑞，王興龍＊

（1.吉林農業(yè)大學，吉林長春130062；2.中國人民解放軍軍事獸醫(yī)研究所 吉林省人獸共患病預防與控制重點實驗室，吉林長春130062；3.中國農業(yè)科學院特產研究所，吉林132109）

布魯菌?。˙rucellosis）簡稱布病，是由布魯菌（Brucella）引起的人獸共患傳染病，嚴重危害畜牧業(yè)和人類健康。近年來，我國布魯菌病疫情形勢較為嚴峻，羊、牛布魯菌病感染率呈上升趨勢，而由病畜引起的人布魯菌病的發(fā)病率也有了明顯的上升［1－2］。

布魯菌屬于胞內寄生菌，主要寄生在巨噬細胞內。目前人們對該菌胞內寄生機制還不清楚［3－4］，這是人畜布魯菌病難以防控的主要原因之一。

本研究利用比較蛋白質組學技術，對牛布魯菌544A感染的巨噬細胞和未感染的巨噬細胞的全細胞蛋白進行了比較分析，對布魯菌感染的和未感染的巨噬細胞的差異蛋白進行質譜鑒定和生物學信息分析，從而分析布魯菌感染后巨噬細胞蛋白組分的變化，為進一步深入研究細菌與宿主相互作用的分子機制和胞內寄生的分子機制提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與細胞株 牛種布魯菌強毒株544A購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。無菌條件下挑取在Tryptic soy agar（TSA）固體培養(yǎng)基上生長的牛布魯菌強毒株544A的菌落加入到5 mL Tryptic soy broth（TSB）液體培養(yǎng)基中，在37℃、200 r／min條件下培養(yǎng)48 h。小鼠巨噬細胞系RAW264.7由吉林大學畜牧獸醫(yī)學院韓文瑜教授惠贈，在無雙抗的1 640培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑和儀器 IPG干膠條（18 cm，p H4～7，非線性）和IPG緩沖液（p H4～7，非線性）、2DQuant蛋白定量試劑盒、礦物油、二硫蘇糖醇（DTT）、Tris、溴酚藍等為GE－Healthcare公司產品；測序級胰蛋白酶為Roche公司產品；冰乙酸、無水乙醇、無水甲醇、甘油為國產分析純；甲醛為優(yōu)級純；吸頭與離心管為AXYGEN公司產品；等電聚焦儀（Ettan IPGphor Isoelectric Focusing System），垂直板電泳儀（Hofer SE 600），掃描儀（UMax Powerlook 2100XL），雙向電泳凝膠圖像分析軟件（Image Master 2D Elite 6.0）均為GE－Healthcare公司產品；超速離心機（3K12，Nr12154）為Sigma公司產品。

1.2 方法

1.2.1 牛布魯菌544A感染巨噬細胞模型的建立按照細胞與細菌1∶300的比例進行感染，感染后于37℃、體積分數(shù)為5%CO2的條件下培養(yǎng)2 h，然后用PBS洗3遍，加入2 mL含20 g／L雙抗、100 mL／L胎牛血清的新鮮細胞培養(yǎng)液，然后每孔加入30μg／mL的慶大霉素6μL［5－7］，繼續(xù)培養(yǎng)2.5 h，經免疫熒光試驗和透射電鏡觀察此時細菌已經完全入侵到細胞內，將此時建立起的布魯菌感染巨噬細胞模型作為進一步提取蛋白使用。

1.2.2 感染巨噬細胞全蛋白的提取 參照高永輝［5］的方法，將制備好的感染布魯菌的巨噬細胞以1 500 r／min離心10 min，將收集的細胞用預冷的低鹽PBS（3 mmol／L KCl，1.5 mmol／L KH2PO4，68 mmol／L NaCl，9 mmol／L Na H2PO4）洗細胞3次，1 500 r／min離心10 min收集細胞到1.5 mL低吸附的EP管中。然后加入0.7 mL超聲裂解液（含蛋白酶抑制劑），冰浴超聲2 min～5 min（SONICS VC 750，小探頭，最大功率的25% ，脈沖2 s，停2 s）。室溫放置1 h以上，讓蛋白質充分溶解。45 000 r／min離心1 h，去除不溶性沉淀，取上清用2－D Quant Kit測定蛋白質濃度。同種方法提取相同數(shù)量未感染的巨噬細胞的全蛋白，并定量，置－70℃保存，用于蛋白質組學分析。

1.2.3 雙向電泳 參照 G?rg A 等［6］描述的雙向電泳方法略加改進。將制備的感染布魯菌的巨噬細胞全蛋白50μL（800μg），加入1.75μL IPG buffer以及水化液至終體積350μL，Vortex混勻，室溫放置30 min，在10℃以13 000 r／min離心1 h；吸取上清平鋪被動水化盤中，將預制的18 cm、p H4～7的IPG膠條緩慢從酸性端一側剝去IPG膠條的保護膜，膠面朝下，緩慢放入水化槽中，注意避免生成氣泡，要使水化液浸濕整個膠條，并確保膠條兩端與電泳槽兩端的電極接觸；IPG膠條上覆蓋2 mL礦物油，蓋上蓋子，常溫下水化20 h；將膠條轉移到膠條槽上，膠面朝上，在膠條的兩端加上電極紙片（Amersham Pharmacia公司產品），夾上電極，保證充分的接觸，覆蓋4 mL礦物油，蓋上蓋子。設置IPGphor儀器運行參數(shù)開始等電聚焦（50 V 2 h，500 V 1 h，1 000 V 1 h，3 000 V 3 h，8 000 V 3 h ，8 000 V聚焦至48 000 V 3 h。電流50μA／膠條，20℃）。將等點聚焦結束后的膠條進行2次平衡，先把膠條放入10 mL含10 g／L DTT的平衡緩沖液中，在水平搖床上緩慢搖動平衡15 min；移出膠條，在10 mL含25 g／L碘乙酰胺的平衡緩沖液中再平衡15 min。將平衡好的膠條在預先配置好的濃度為120 g／L的SDS－PAGE凝膠中進行分離，采用恒功率方式電泳，12℃循環(huán)水浴冷卻。先在功率為1 W／gel條件下電泳30 min后，當溴酚藍移出膠條后再將功率加大至12 W／gel，當溴酚藍移到凝膠底部時中止電泳，用銀染的方法對電泳凝膠進行染色分析。

1.2.4 圖像掃描和分析 分別將牛布魯菌強毒株544A感染和未感染的巨噬細胞全蛋白分離的兩組凝膠（每組3塊凝膠）掃描后，用Image Master 2D Platinum雙向電泳凝膠圖像分析軟件進行對比分析，尋找差異表達的蛋白點。蛋白質點的分子質量根據(jù)電泳時加入的預染標準蛋白Marker的位置而確定，等電點根據(jù)所用IEF膠條的p H范圍計算。根據(jù)軟件獲取每個蛋白點的豐度值，挑選表達豐度差異在2倍以上的蛋白點作為差異點。

1.2.5 膠內酶切及MALDI－TOF質譜檢測 將差異蛋白點從凝膠上挖取下來，裝在含100μL去離子水的離心管里，寄往上海生命科學院進行膠內酶切和MALDI－TOF質譜鑒定。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 根據(jù)質譜鑒定所提供的相關數(shù)據(jù)進行差異蛋白相關數(shù)據(jù)的檢索，并主要對這些差異蛋白的功能進行了分析。

2 結果

2.1 牛布魯菌感染巨噬細胞的透射電鏡觀察

根據(jù)透射電鏡觀察所需的步驟處理牛布魯菌544A感染4.5 h的巨噬細胞，牛布魯菌在感染后4.5 h可以通過透射電鏡清楚地觀察到細胞內的細菌（圖1）。

圖1 布魯菌感染巨噬細胞后的電鏡觀察Fig.1 The electron microscope observation Brucella of macrophages with infected

2.2 牛布魯菌感染巨噬細胞的間接免疫熒光檢測

用豚鼠抗牛布魯菌的陽性血清和FITC偶聯(lián)的兔抗豚鼠IgG分別作為一抗和二抗，對感染后4.5 h的巨噬細胞進行免疫熒光檢測，觀察布魯菌對巨噬細胞的感染情況。細胞內出現(xiàn)明顯的熒光，說明布魯菌已經侵入到細胞內（圖2）。

圖2 布魯菌感染巨噬細胞后的免疫熒光檢測Fig.2 The immunofluorescence detection of Brucella infected macrophages

2.3 感染牛布魯菌強毒株544A和未感染巨噬細胞的雙向電泳圖譜

感染布魯菌和未感染布魯菌的巨噬細胞全細胞蛋白經過雙向電泳分離，結果如圖3A和3B所示，蛋白點在p H4～7范圍內分布比較集中，每個樣品經過6次重復，用Image Master 2D Platinum 雙向電泳凝膠圖像分析軟件進行對比分析后，結果有13種蛋白差異表達，差異表達的蛋白被分別標記在圖3A和3B中。

圖3 巨噬細胞感染布魯菌后的全細胞蛋白的差異表分析Fig.3 The macrophage Brucella infected whole－cell protein analysis of the difference types

2.4 差異蛋白的質譜鑒定和生物學信息檢索結果

通過生物學信息分析，13個差異蛋白點代表了12種蛋白質。這些蛋白質主要與細胞的代謝、細胞骨架合成、蛋白損傷修復以及基因的轉錄調控等生物過程密切相關。

2.4.1 磷酸丙糖異構酶（triosephosphate isomerase，TPI） 在糖酵解過程中發(fā)揮重要的作用，是最有效的能量物質。

2.4.2 鋅指蛋白2（zinc finger protein 2） 鋅指蛋白是一類具有手指狀結構域的轉錄因子，在基因調控中起著重要的作用，具有廣泛的生物功能，如DNA識別，RNA包裝，轉錄及轉錄后調控，蛋白折疊和裝配，參與腫瘤的形成且與機體免疫系統(tǒng)密切相關等。

2.4.3 半胱氨酸蛋白酶抑制劑 （cystatin－B）Cystatin－B蛋白在人類被CSTB基因編碼，缺失可能與人類的進行性肌陣攣性癲癇發(fā)生有關。

2.4.4 延伸因子2（elongation factor 2，EF2） 蛋白質延長過程中起作用的GTP水解酶。

2.4.5 天冬氨酸轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST） AST是氨基酸代謝過程中重要的酶，其升高與細胞的損傷和壞死相關。

2.4.6 酸性核磷酸蛋白pp32（acidic nuclear phosphoprotein pp32） 是一種富含亮氨酸的酸性核蛋白，在細胞增殖，凋亡m RNA轉運，信號轉導和細胞骨架動力學等多種生物過程發(fā)揮重要的作用。

2.4.7 protein 71 ku熱休克同源蛋白（heat shock cognate 71 ku） 作為轉錄激活的阻抑物，阻止轉錄輔激活因子CITED1在Smad介導的轉錄上的活性。

2.4.8 鐵蛋白輕鏈1（ferritin light chain 1 FTL）是鐵蛋白的一種亞基，是細胞內主要的鐵儲存蛋白。儲存機體中的過剩鐵，避免產生鐵中毒和釋放鐵給需鐵的細胞，用于體內生物合成含鐵的蛋白質或酶，對鐵離子的自身穩(wěn)定起到重要的作用。

2.4.9 鐵蛋白輕鏈1（ferritin light chain 1 FTL）是鐵蛋白的一種亞基，是細胞內主要的鐵儲存蛋白。儲存機體中的過剩鐵，避免產生鐵中毒和釋放鐵給需鐵的細胞，用于體內生物合成含鐵的蛋白質或酶，對鐵離子的自身穩(wěn)定起到重要的作用。

2.4.10 26 S蛋白酶－非ATP酶（26 S proteasome，non－ATPase subunit） 與肝細胞癌密切相關。

2.4.11 細胞質型蘋果酸脫氫酶（cytosolic malate dehydrogenase） 蘋果酸脫氫酶普遍存在于各種生物中，它負責催化草酰乙酸和蘋果酸之間的相互轉換。根據(jù)其輔酶的特異性和在細胞內的分布和生理功能的不同。

2.4.12 亞砷酸鹽甲基化轉移酶（arsenite methyltransferase） 參與體內砷的甲基化過程。

2.4.13 5－β微管蛋白（tubulin beta－5 chain） 是微管的主要成分，構成細胞骨架的結構成分，結合2分子的GTP。

3 討論

布魯菌感染后主要寄生在巨噬細胞內，并可以逃避巨噬細胞的吞噬并在巨噬細胞內繁殖，這是布魯菌致病的主要機制［5－6］。為進一步了解布魯菌的致病機制，本研究從布魯菌感染的和未感染的巨噬細胞本身所發(fā)生的蛋白變化的角度，對布魯菌感染后所引起的巨噬細胞蛋白質組成所發(fā)生的改變進行深入研究，從而為揭示布魯菌在宿主細胞內的寄生機制提供依據(jù)。

牛布魯菌544A是國際標準的牛種布魯菌強毒株，侵入機體后在宿主細胞內寄生，并引起機體發(fā)病。為此，本研究建立了牛布魯菌感染巨噬細胞的模型，根據(jù)透射電鏡和免疫熒光觀察結果顯示布魯菌已經侵入巨噬細胞內。進而利用2－DE技術和蛋白質譜鑒定相結合的方法來比較分析牛布魯菌544A感染的和未感染的巨噬細胞的蛋白質組變化，結果共確定了13個差異點，對應12個蛋白質編碼基因。通過對這些蛋白的生物學信息進行檢索，發(fā)現(xiàn)它們主要參與了細胞的代謝、細胞骨架合成、蛋白損傷修復以及基因的轉錄調控等生物過程。

布魯菌在胞內寄生，需要消耗細胞的能量來完成其在胞內的運輸和繁殖，同時布氏小體內表現(xiàn)出營養(yǎng)缺乏和微需氧，相應的在這些參與運輸和復制“溫室”中長期生存和復制過程中也需要布魯菌做大量的代謝改變［7］。為此，本研究中發(fā)現(xiàn)與糖酵解、能量代謝、離子運輸相關的酶發(fā)生了表達上的改變，如TPI、MDH、ferritin light chain 1 等，這些蛋白在表達上的改變與布魯菌在細胞內寄生機制相一致，提示這些蛋白也可以作為抗布魯菌入侵的靶蛋白進行深入的研究。

此外，布魯菌強毒株能在宿主細胞內存活并大量繁殖，另外一個主要的因素是布魯菌抑制吞噬體（phagosome）的成熟，使吞噬了布魯菌的巨噬細胞喪失正常的功能，不能與溶酶體正常融合，從而產生一個具有內吞體性質而非溶酶體性質的有益于細菌在細胞內生存的酸性空間——布氏小體［8－10］。文獻報道［11］，布魯菌強毒株侵襲巨噬細胞后在布魯菌抑制吞噬體成熟的過程中，布魯菌抑制了宿主細胞內與凋亡和細胞周期有關的基因，本試驗結果表明，強毒株感染后與細胞凋亡、損傷相關的蛋白都發(fā)生了改變（如酸性核磷酸蛋白pp32、26S proteasome、non－ATPase和AST等），進而證明了上述觀點。

布魯菌感染后宿主細胞會有氧化應激反應的發(fā)生，這將會導致細胞內許多生物大分子（蛋白質、核酸等）的結構和功能發(fā)生損傷，為了維持蛋白質等大分子的正常結構、功能和細胞的生理功能，熱休克蛋白（HSP）等分子伴侶表達上調，71 ku熱休克同源蛋白、elongation factor 2、zinc finger protein 2等幫助蛋白修復和折疊的分子表達升高，以恢復變性蛋白的功能。

布魯菌強毒株感染宿主細胞是一個復雜的生物反應過程，并且導致細胞多個系統(tǒng)的功能和結構都發(fā)生了改變，尤其是宿主細胞的骨架結構、信號轉導、能量代謝方式、細胞損傷后的修復等都發(fā)生了很大的變化。為此，上述這些方面發(fā)生改變的蛋白質都將成為我們今后研究布魯菌在宿主細胞內寄生機制的靶蛋白，它們的過表達或抑制能否幫助宿主細胞抵抗布魯菌的入侵需要進一步研究。同時由于雙向電泳技術自身的缺陷［12］，相對于細胞內蛋白質組的上萬種蛋白質來說，我們也只能粗略的對細胞內的部分蛋白質進行分析，一些差異蛋白可能未被鑒定出來，這些技術都需要進一步改善。

［1］齊景文.2002—2008年沈陽市畜間布魯氏菌病監(jiān)測分析［J］.中國動物檢疫，2010，27（2）：53－54.

［2］趙永利，王大力，冮森林等.2005—2006年布氏菌病全國監(jiān)測報告［J］.中國地方病防治雜志，2008，23（1）：38－40.

［3］Kohler S，Porte F，Jubier M V，et al.The intramacrophagic environment of Brucella suis and bacterial response［J］.Vet Microbiol，2002，90（124）：299－3091.

［4］Ko J，Splitter G A.Molecular Host－pathogen interaction in brucellosis：Current understanding and future approaches to vaccine development for mice and humans［J］.Clin Microbiol Rev，2003，16（1）：765－781.

［5］高永輝，任 昶，應天翼，等.感染布氏桿菌后的THP－1細胞的蛋白質組學研究［J］.微生物學報，2006，46（4）：629－634.

［6］Gorg A，Obermaier C，Boguth G，et al.The current state of two－dimensional electrophoresis with immobilized p H gradients［J］.Electrophoresis，2000，21（6）：1037–10531.

［7］Roop R M，Bellaire B H，Valderas M W，et al.Adaptation of the brucellae to their intracellular niche［J］.Mol Microbiol，2004，52（3）：621－6301.

［8］Watarai M，Makino S，F(xiàn)ujii Y，et al.Modulation of Brucellainduced macropinocytosis by lipid rafts mediates intracellular replication［J］.Cell Microbiol，2002，4：341－355.

［9］Porte F，Liautard J P，Khler S.Early acidification of phagosomes containing Brucella suis is essential for intracellular survival in murine［J］.Macro Infect Immun，1999，67（8）：4041－4047.

［10］Celli J，Gorvel J P.Organelle robbery：Brucella interactions with the endoplasmic reticulum［J］.Curr Opin Microbiol，2004，7（1）：93－971.

［11］Eskra L，Mathison A，Splitter G.Microarray analysis of mRNA levels from RAW26417 macrophages infected with Brucella abortus［J］.Infect Immun，2003，71（3）：1125－11331.

［12］Rabilloud T.Two－dimensional gel electrophoresis in proteomics：Old，old fashioned，but it still climbs up the mountains［J］.Proteomics，2002，2（1）：3－101.