吳 煒，張曉燕，唐宇龍，方麗華，方維煥

（浙江大學動物預防醫(yī)學研究所，浙江省動物預防醫(yī)學重點實驗室，浙江杭州310058）

豬鏈球菌2型（Streptococcus suis 2，SS2）是豬鏈球菌各個血清型中毒力最強、流行最廣泛的血清型，是重要的人獸共患病病原［1］。豬鏈球菌溶血素（suilysin，SLY）是較早確定的豬鏈球菌毒力因子之一，屬巰基活化的溶細胞素家族（thiol activated cytolysin group，TACY）溶血素，序列分析表明SLY具有該家族的同源保守序列，且此序列與細菌的溶血活性有重要關系。Staats J J等［2］報道19株鏈球菌2型菌株中有5株SLY為陽性，而這5株菌都是高毒力株，而其他SLY為陰性的菌株都是低毒力或無毒力株。研究表明，溶血素可以增強SS2對上皮細胞的侵襲和裂解能力［3］；溶血素陽性菌株的黏附和細胞毒性在腦膜炎過程中起作用［2］。對溶血素基因分析表明，強毒力菌株大多攜帶sly基因，而低致病力菌株不溶血，且其5′端多有突變或缺失［4］。

本研究利用pSET4S溫敏性自殺質粒，通過同源重組方法構建sly基因缺失株，分析突變株的生物學特性，為進一步研究SLY介導SS2的感染生物學機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

豬鏈球菌2型分離株1105為浙江省動物預防醫(yī)學重點實驗室于2008年分離自病豬肺臟的強毒株；E.coli DH5α由浙江省動物預防醫(yī)學重點實驗室保存；pSET4S質粒由日本國家動物健康研究所（National institute of animal health，Japan）Daisuke Takamatsu博士惠贈；腦微血管內皮細胞Bend3和小鼠單核巨噬Raw246.7為浙江省動物預防醫(yī)學重點實驗室保存；腦心浸出液培養(yǎng)基（Brain heart infusion，BHI），Tryptone和 Yeast extraction為OXOID公司產品；氯霉素和大觀霉素為上海生工生物工程技術服務有限公司產品；引物由上海Invitrogen生物技術有限公司合成；DNA割膠回收和純化試劑盒為Axygen公司產品；質粒抽提試劑盒為北京全式金生物技術有限公司產品；T4連接酶和DNA限制性內切酶均為Takara公司產品；雌性Balb／c小鼠購自浙江省中醫(yī)院動物試驗中心。

1.2 方法

1.2.1 同源重組質粒的構建

1.2.1.1 自殺載體元件的PCR擴增 構建重組質粒pSET4S：：cat－ΔSly：根據 NCBI上豬鏈球菌2型P1／7標準株的基因（NC－012925.1）中的 Sly序列（1258902－1262814）設計引物（表1）。PCR反應條件及體系：10×buffer 3μL，10 mmol／L d NTP 1.0 μL，上游引物 1.0μL，下游引物1.0μL，template 2.5μL，super Tag 0.5μL，dd H2O 21μL。PCR反應程序為：94℃3 min；94℃30 s，54℃40 s，68℃90 s，30個循環(huán)；68℃繼續(xù)延伸10 min。PCR產物用10 g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.1.2 自殺載體元件的酶切和連接 用引物Sly－1／Sly－2和Sly－3／Sly－4分別擴增Sly－5′和Sly－3′片段，PCR擴增產物割膠回收純化后，分別用引物Sly－1／4進行融合PCR擴增。割膠產物片段用Eco RⅠ和SphⅠ雙酶切3 h，再回收純化，得到的片段和經過相對應雙酶切處理的pSET4S用T4連接酶過夜連接，構建自殺質粒pSET4S－ΔSly。用引物CH1／CH2從p MD18T－cat中PCR擴增cat基因，Eco T22I酶切處理pSET4S－ΔSly與cat基因PCR產物，用T4連接酶過夜連接，構建得到帶cat基因的pSET4S：cat－ΔSly（圖1）。

表1 構建重組自殺載體所用PCR引物Table1 Primers used for construction recombinant suicide vector

圖1 pSET4S：cat－Δsly質粒構建示意圖Fig.1 Schematic representation of the procedures for construction of pSET4S：cat－Δsly

1.2.1.3 自殺質粒的鑒定和測序 將pSET4S：cat－ΔSly轉化至E.coli DH5α感受態(tài)細胞，選擇含抗性Spc 50μg／mL，Cm 8μg／mL的LB固體培養(yǎng)基篩選陽性克隆，并送上海Invitrogen生物技術有限公司測序。

1.2.2 豬鏈球菌2型菌株感受態(tài)的制備與電轉參考 Takamatsu D等［5］SS2感受態(tài)的制備方法，電轉條件為2 500 V、25 m A和200Ω。將pSET4S：cat－ΔSly電轉至SS2－1105菌株內，利用含抗性Spc 100μg／mL和Cm 4μg／mL的BHI平板篩選陽性菌株，進行PCR擴增，鑒定并比較同源臂片段大小。

1.2.3 插入cat抗性基因法同源重組篩選sly基因缺失株 將鑒定電轉成功的SS2菌株，先于含Spc和Cm抗性BHI培養(yǎng)基中28℃培養(yǎng)16 h至對數(shù)生長期中期，然后1∶1 000轉接至新鮮的只含Cm抗性BHI培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)6 h至對數(shù)生長期早期，將細菌從28℃培養(yǎng)箱移至37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，4 h后取100μL涂板（只含Cm抗性BHI平板），37℃培養(yǎng)過夜，24 h后挑斑PCR鑒定（鑒定Spc抗性基因是否消除和比較同源臂片段大?。?，構建得到以SS2－1105為親本株的sly基因缺失株，即SS2－1105－Δsly。插入cat的sly基因片段臨近區(qū)域再經PCR鑒定和測序驗證（鑒定引物P1：AGCTTGA CTTACGAGCCACAAG AG；P2：CCACCATTCCCAAGCTAAT CCTGT，可以擴增親本菌株完整的sly－ORF）。

1.2.4 體外溶血試驗 根據 Ono T等［6］建立的方法加以改進，測定突變株與親本株在全血中的溶血活性。方法如下：①從綿羊血中分離紅細胞，配成50 mL／L的 RBC－1640懸液；②取5 mL 37 ℃過夜培養(yǎng)物5 000 r／min離心6 min收集菌體，用滅菌10 mmol／L PBS洗兩遍，用適量PBS重懸細菌，調整菌株濃度至109cfu／mL；③取10μL細菌懸液（即實際細菌量在107cfu左右）與500μL濃度為50 mL／L RBC－1640懸液加入 EP管中，2000 r／min離心2 min后，37℃靜置培養(yǎng)。每個菌株設3個平行，每1 h為一組，共設6組（包括0 h組），每組設陰性與陽性對照各3管（用PBS代替細菌懸液）。每隔1 h取出一組，在陽性對照中加入Triton X－100至終濃度2 mL／L，劇烈震蕩后12 000 r／min離心1 min，取上清200μL測定OD570 nm值；其余處理管溫和顛倒混勻后12 000 r／min離心1 min，取上清200μL測定OD 570 nm值。樣品與相應時間點陰性OD 570 nm值分別取平均值后的差值作圖。

1.2.5 對Bend3腦血管內皮細胞毒性試驗Bend3細胞為鼠源的腦血管內皮細胞，培養(yǎng)于含100 mL／L胎牛血清的1640培養(yǎng)基，鋪于96孔細胞培養(yǎng)板中，4×104／孔～6×104／孔。親本株及缺失株復蘇后，1∶100轉接至新鮮BHI培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3 h～4 h至對數(shù)生長期中期，用滅菌的10 mmol／L PBS洗兩遍，調節(jié) OD 600nm值至0.5左右，10倍稀釋于1640基礎培養(yǎng)液中，每孔加入100 μL含細菌的培養(yǎng)液（加入菌液前，細胞先棄上清，后用用溫浴滅菌的10 mmol／L PBS清洗細胞3遍），使細菌與細胞的MOI為1∶1 000。37℃體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)，設立自身釋放LDH的陰性對照與裂解細胞的陽性孔，每加樣孔3個平行。在1 h和2 h培養(yǎng)后，吸取50μL細胞上清液至96孔微量反應板，加入底物顯色液50μL，黑暗反應30 min，再加入50μL反應終止液，490 nm酶標儀進行檢測讀數(shù)。細胞毒性的計算方法：（試驗孔值－細胞LDH自身釋放值）／（細胞完全裂解釋放LDH陽性值－細胞LDH自身釋放值）×100%。

1.2.6 在Raw246.7巨噬細胞中存活力 用含100 mL／L胎牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)Raw246.7細胞，鋪于24孔培養(yǎng)板中，2×105個／孔～4×105個／孔。親本株及突變株復蘇后，按上述方法培養(yǎng)和洗滌，調節(jié)OD 600 nm至0.5左右，10倍稀釋至含100 mL／L胎牛血清的1640細胞培養(yǎng)液中，每孔加入500μL含細菌的培養(yǎng)液，使細菌與細胞的MOI為1∶100。在37℃、體積分數(shù)為CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)45 min后棄去細胞孔中液體，用溫浴滅菌的10 mmol／L PBS清洗細胞3遍，加入終濃度為100μg／mL慶大霉素的1640培養(yǎng)基，在37℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h后，棄去上清，用溫浴滅菌的10 mmol／L PBS清洗細胞3遍，加入含100 mL／L的胎牛血清的1640細胞培養(yǎng)，在37℃、體積分數(shù)為5%的CO2細胞培養(yǎng)箱內繼續(xù)放置1、2、3 h。處理完的孔先用PBS洗細胞3遍，后用100μL胰酶處理10 min，再用冰浴的滅菌蒸餾水使細胞裂解，裂解液10倍連續(xù)稀釋后，去適當稀釋度的菌液進行平板計數(shù)。

2 結果

2.1 同源重組質粒和sly基因缺失突變SS2菌株的鑒定

用于同源重組的自殺質粒pSET4S：cat－Δsly，用PCR擴增同源臂片段（引物Sly－1／4）進行鑒定，大小為3 523 bp，比SS2基因組的同源片段短約390 bp（圖2）。重組質粒轉化到E.coli DH5α中，提取質粒對目的片段進行測序，與參考菌株菌株P1／7的基因序列（NC－012925.1）同源性98.5%以上，表明目的片段已經成功克隆于載體。

通過28℃和37℃細菌傳代后質粒凋亡，同源重組完成，突變株通過PCR擴增鑒定（圖3）。用sly兩側特異引物擴增親本菌株的ORF片段為1 491 bp，而SS2－Δsly突變株擴增攜帶有cat基因和部分sly基因片段為1 103 bp（圖4），經序列測定和分析，擴增片段內含cat基因。

2.2 缺失突變株SS2－1105－ΔSly體外溶血活性消失、細胞毒性顯著降低

圖4表明，親本株的溶血活性從0 h時刻到2 h時持續(xù)升高，而sly基因缺失株的溶血消失。突變株SS2－1105－ΔSly對小鼠腦微血管內皮細胞的細胞毒性顯著低于親本株（圖4），說明溶血素是SS2對Bend3細胞產生損傷的主要毒力因子。

圖4 溶血素缺失株SS2－ΔSly與親本株體外溶血活性（左）和細胞毒性（右）比較Fig.4 Comparison between sly deletion mutant and its wild－type strain in hemolytic activity（left）and cytotoxicity（right）

2.3 缺失株SS2－1105－ΔSly在 Raw246.7細胞中的存活力

將各時間點的細菌數(shù)除以相對應菌株0時刻（慶大霉素處理1 h）的起始細菌總數(shù)，得到對應的細菌在巨噬細胞內的存活率。SS2親本菌株在Raw246.7細胞中的存活率隨共培養(yǎng)時間的增加逐漸降低，溶血素基因缺失株在細胞中的存活能力并沒明顯變化（圖5），初步表明溶血素不影響對SS2在巨噬細胞中的存活。

3 討論

豬鏈球菌2型是重要的人獸共患致病菌，但其致病機制還不完全清楚［7］，研究表明豬溶血素SLY在其致病過程中起重要作用，是一種重要的毒力因子［8］。SLY對不同的上皮細胞系，腦微血管內皮細胞和巨噬細胞等有細胞毒性。SLY可能在豬鏈球菌致腦膜炎過程中起作用，但具體的作用機制還不清楚［9］。

圖5 溶血素缺失株SS2－ΔSly與親本株在RAW264.7巨噬細胞內存活力比較Fig.5 Comparison between sly deletion mutant and its wild－type strain in survival within macrophage cell line RAW264.7

豬溶血素還是良好的保護性抗原［10］。Jacobs A A等［11］將豬鏈球菌2型的SLY提純后免疫Balb／c小鼠，小鼠得到了完全的免疫保護，證明SLY具有重要的免疫保護作用，并推測豬鏈球菌2型的溶血素同時對其他類型的豬鏈球菌有交叉保護作用。Jacobs A A等［12］進一步將SLY與豬鏈球菌2型的其他細胞外抗原（extracellular antigens）對豬的免疫保護作用進行了對比，證實SLY的免疫保護作用要明顯優(yōu)于不含溶血素的其他細胞外抗原。Institut M等［13］利用天然缺失豬溶血素的2型和9型豬鏈球菌進行活苗的保護力試驗，但結果并沒有產生抗體和免疫力。Lun S等［14］研究認為，豬鏈球菌2型的溶血素可能并不介導細菌對呼吸系統(tǒng)的感染，但在刺激細胞因子釋放和先天免疫過程中具有一定作用。然而，SLY在腦內感染中是否起作用，如何起作用還未見相關研究報道。

本研究利用p EST4S溫敏性自殺質粒，通過同源重組和抗性基因置換構建sly基因缺失突變株，通過溫度和抗性基因兩個選擇壓力，提高了獲得陽性突變株的概率，為在細胞和分子水平深入研究SLY在SS2致病中的作用奠定了基礎。

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