張文奎，趙紅艷，龍 淼，郭 洋，王鳳龍

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧沈陽110866；3.本溪市動植物園管理辦公室，遼寧本溪117000）

犬瘟熱是由犬瘟熱病毒（CDV）引起的烈性、高致死性傳染?。?］，易感動物包括犬科、浣熊科、貓科、海豹科等［2］。除了犬之外，我國北方飼養(yǎng)的毛皮動物狐貍、貉、貂都是犬瘟熱病毒的易感動物，此病對皮毛獸養(yǎng)殖造成很大危害。一旦養(yǎng)殖戶因未及時給動物接種疫苗而造成發(fā)病，往往引起大群死亡［3］。即使在疫苗廣泛使用的前提下，還會經(jīng)常出現(xiàn)犬瘟熱發(fā)生。因此，早期診斷是防治犬瘟熱的重要前提。目前對于犬瘟熱的診斷有了大量的報道，但對于采用HE及免疫組化的方法進(jìn)行犬瘟熱病毒的組織定位研究報道很少。雖然一些報道描述了該病毒存在于一些有限的器官，如肺、腦、腎、腸道、腳墊、淋巴器官［4－5］，但CDV在貉的各個組織中的分布規(guī)律及究竟哪些組織器官最適宜進(jìn)行病理學(xué)診斷還尚未有人研究。本研究采用HE染色方法對犬瘟熱感染的病貉進(jìn)行CDV組織包涵體檢測，并采用免疫組化方法證明貉發(fā)生犬瘟熱時CDV在組織臟器中的分布規(guī)律，進(jìn)而確定哪些織器官最適宜于進(jìn)行犬瘟熱診斷。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用動物 2010年－2011年，在遼寧地區(qū)共搜集到犬瘟熱確診病貉79只，患貉病程從1周到1個月不等。根據(jù)臨床癥狀懷疑為犬瘟熱，經(jīng)過問診，這些病貉沒有被注射過疫苗，表現(xiàn)的臨床癥狀多種多樣，包括鼻腔有大量分泌物、咳嗽、肺炎、腹瀉、結(jié)膜炎、結(jié)痂、硬足墊及神經(jīng)綜合征。剖檢的主要癥狀是肺炎，腸炎，脾、胸腺、淋巴結(jié)萎縮。通過犬瘟熱免疫試紙條法確診所搜集的貉為犬瘟熱病貉。

1.1.2 樣本采集 犬瘟熱病貉的肺、腦、腎、胃、脾、淋巴結(jié)、扁桃體、鼻、足墊、支氣管。

1.1.3 試劑與儀器 犬瘟熱單克隆抗體（美國維爾康WELLCAN）為北京寵必威生物科技有限公司產(chǎn)品；DAB顯色劑為北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；抗原修復(fù)液、封閉用羊血清、抗體稀釋液和山羊抗小鼠IgG抗體－HRP多聚體二抗為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；QPJ－1B切片機為天津天利航空機電有限公司產(chǎn)品；OLYMPUS顯微鏡為廣州思貝舒檢測儀器公司產(chǎn)品；PAP筆（ZLI－9070）和防脫磨砂載玻片為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 切片制作 將固定于100 mL／L中性福爾馬林溶液中的肺、腦、腎、胃、脾、各種淋巴結(jié)、扁桃體、腳墊、鼻常規(guī)石蠟包埋制塊，切片（3μm），撈于防脫磨砂載玻片上，50℃烤片5 h，37℃溫?zé)徇^夜。

1.2.2 HE染色 根據(jù)王鳳龍編寫的動物病理及檢驗技術(shù)中HE染色步驟進(jìn)行［6］。

1.2.3 免疫組化染色 石蠟切片脫蠟至水：二甲苯Ⅰ15 min；二甲苯Ⅱ10 min；1 000 mL／L乙醇Ⅰ5 min；1 000 mL／L乙醇Ⅱ5 min；950 mL／L乙醇5 min；900 mL／L 乙 醇 5 min；700 mL／L 乙 醇5 min，蒸餾水沖洗2 min×3次，PBS液浸泡5 min×3次；擦掉切片上組織周圍的液體，用PAP筆在組織周圍劃圈，放入底部盛有PBS的濕盒中，滴加30 mL／L H2O2阻斷劑于組織上，室溫避光孵育20 min，PBS液沖洗，5 min×3次；血清封閉：羊血清工作液滴加在組織上，37℃孵育30 min，甩掉血清，勿沖洗；滴加抗體稀釋液1∶100稀釋的犬瘟熱單克隆抗體，4℃過夜（14 h以上）；陰性對照加PBS；37℃復(fù)溫45 min，PBS洗，5 min×3次；滴加山羊抗小鼠IgG抗體－HRP多聚體二抗，37℃孵育60 min，PBS沖洗，5 min×3次；DAB顯色：先將DAB試劑中的A液一滴加入1 mL蒸餾水中混勻，再加入1滴B液和1滴C液混勻使用，現(xiàn)用現(xiàn)配。滴加在組織上顯色3 min～10 min，顯微鏡下控制顯色；切片入蒸餾水，再用自來水沖洗終止顯色；蘇木素復(fù)染：在蘇木素中染色4 min；自來水沖洗，蒸餾水浸泡；鹽酸酒精分化；自來水泛藍(lán)20 min；酒精梯度脫水；二甲苯透明；中性樹膠封片。

2 結(jié)果

免疫組化法檢測犬瘟熱病毒在犬瘟熱病貉體內(nèi)的分布規(guī)律如圖1所示，所檢測病貉共79只，在病貉各個組織器官檢測到犬瘟熱病毒的比例如下：在肺部占72%，大腦占24%，膀胱占74%，胃占80%，脾占77%，淋巴結(jié)占80%，扁桃體占100%，足墊占89%，鼻黏膜占87%，支氣管占90%。表明CDV在犬瘟熱病貉扁桃體分布最廣，在其他組織器官也有廣泛的分布。

圖1 免疫組化法檢測犬瘟熱病毒在貉組織器官的分布比例Fig.1 Distribution rate of canine distemper virus in the various tissues of the raccoon dogs

在光鏡下觀察HE染色組織切片，發(fā)現(xiàn)在腎小管上皮細(xì)胞中包涵體成紅染圓形團(tuán)塊（圖2A），小腦顆粒層細(xì)胞內(nèi)見包涵體為卵圓形紅染團(tuán)塊（圖2B），肺泡壁細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)卵圓形紅染團(tuán)塊包涵體（圖2C），在脾臟，淋巴細(xì)胞減少，在網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)可見嗜酸性包涵體（圖2D）。免疫組化結(jié)果表明，除了上述器官之外，在足墊顆粒層細(xì)胞內(nèi)有陽性著色顆粒（圖3A），鼻頭顆粒層細(xì)胞與角質(zhì)層內(nèi)有散在陽性信號（圖3B），支氣管上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)見強陽性信號（圖3C），扁桃體網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)強陽性信號（圖3D）。淋巴器官變化很大，主要是扁桃體、脾臟和淋巴結(jié)顯著萎縮并伴有淋巴數(shù)量減少，嗜酸性胞內(nèi)包涵體在網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞和淋巴細(xì)胞內(nèi)大量出現(xiàn)。

3 討論

死后檢測CDV是確定犬瘟熱感染最準(zhǔn)確的方法。由于CDV的自然親嗜細(xì)胞是上皮細(xì)胞，因此以前的研究中，胃黏膜、眼結(jié)膜、腎黏膜被認(rèn)為是檢測CDV最可靠的器官［7］。但在我們的研究結(jié)果顯示的是包涵體在扁桃體的檢出率要高于其他器官。居于第二位的是呼吸系統(tǒng)的各個器官。CDV在淋巴組織復(fù)制并經(jīng)由被感染的淋巴細(xì)胞傳播到其他組織。由于自然傳播途徑是經(jīng)過吸入途徑［1，8］，病毒的復(fù)制應(yīng)該首先在呼吸道的淋巴組織細(xì)胞進(jìn)行。因此，CDV 能在扁桃體早期階段檢測到［1，9］。CDV 感染在早期階段可引起淋巴組織中的T細(xì)胞和B細(xì)胞顯著減少，這和其他麻疹病毒屬的病毒如（麻疹病毒、牛瘟病毒）傳染的特點一樣［10］。事實上，很多研究支持這樣的傳染過程［1，9］，并且大量的 CDV 在早期直至晚期都可以存在淋巴器官，而且在淋巴器官內(nèi)檢測到，尤其是扁桃體［11］。

本試驗也進(jìn)行了HE組織學(xué)檢驗，觀察包涵體的存在，但該方法沒有免疫組化法敏感，采用HE染色沒有在足墊上皮細(xì)胞和鼻頭上皮細(xì)胞檢測到包涵體，但是采用免疫組化的方法確定了CDV病毒在此部位的存在。而且有文獻(xiàn)報道，采用免疫組化的方法對足墊上皮細(xì)胞及鼻頭上皮細(xì)胞CDV的檢測，是對犬瘟熱生前診斷的最佳組織［12］。

本研究采用免疫組化法確定了CDV在犬瘟熱病貉組織的分布特點，為病理組織學(xué)確診貉犬瘟熱診斷提供參考。本研究結(jié)果表明最適宜確診貉犬瘟熱的病理組織學(xué)檢查器官是扁桃體。

圖2 HE染色組織切片，光鏡下觀察Fig.2 HE staining sections under light microscopy

圖3 免疫組化法檢測犬瘟熱病毒在貉部分器官中的分布Fig.3 The distribution of CDV in tissue samples by immunlhistochemistry detection

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