劉國乾，曹 藍(lán)，和 君，馮軍祥，張長輝，田 進(jìn)，焦培榮，亓文寶，廖 明

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，人獸共患病防控制劑國家地方聯(lián)合工程實驗室，農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點(diǎn)實驗室，廣東省動物源性人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實驗室，廣東廣州510642）

禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）變異頻繁，血清亞型眾多，迄今已發(fā)現(xiàn)16種HA亞型和9種NA亞型。1966年，H9N2亞型AIV首次分離于北美洲，1994年在中國大陸首次分離到，并逐漸成為中國大陸流行的AIV亞型［1］。近年的研究結(jié)果表明，H9N2亞型AIV的HA基因大部分來自于Ck／BJ－like，并且通過與 G1－like、G9－like（代表毒株為 A／Chicken／Hong Kong／G9／97）、Y439－like（代表毒株為 A／duck／Hong Kong／Y439／97）及SH／F／98－like（代表毒株為 A／Chicken／Shanghai／F／98）基因重組，形成了多基因型H9N2 AIV［2］。

H9N2亞型AIV為低致病力病毒，分布廣泛，能引起呼吸道癥狀和產(chǎn)蛋下降，并造成宿主的免疫抑制，以及與其他病原微生物通過協(xié)同作用引起禽類發(fā)?。?－5］。該病毒不僅對家禽具有危害，還可以跨宿主傳播，感染哺乳動物，具有可能產(chǎn)生抗原特性與遺傳特性都完全有別于禽流感的新型流感病毒風(fēng)險［6］。一些H9N2亞型AIV獲得人流感病毒的一些特異性受體，可以感染人類，引起輕微的呼吸道疾?。?－8］。而且，H9N2亞型 AIV 對 H5N1亞 型 AIV病毒的基因多樣性具有一定貢獻(xiàn)，1997年流行的H5N1亞型禽流感的內(nèi)部基因可能來源于G1－like［9］。這些發(fā)現(xiàn)表明H9N2亞型AIV存在在人與家禽中流行的風(fēng)險。因此，對H9N2亞型AIV的研究不僅有助于了解其在畜禽中的流行特點(diǎn)，而且還具有重要的公共衛(wèi)生意義。

本研究對3株華南地區(qū)不同年代分離的H9N2 AIV分離株的全基因組進(jìn)行了序列測定，并進(jìn)行了詳細(xì)的系統(tǒng)進(jìn)化分析，為解析華南地區(qū)H9N2 AIV的分子流行病學(xué)特點(diǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病 毒 CK／GD／162／03、Francolin／GD／298／05、Ck／GD／A8／10 3株 H9N2亞型禽流感病毒毒株，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院傳染病教研室分離、鑒定并保存。

1.1.2 試劑 Trizol試劑為Invitrogen公司產(chǎn)品；DNA Marker DL2000、d NTPs（each2.5 mmol／L）、RNA酶抑制劑和反轉(zhuǎn)錄酶M－MLV均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；EZNA Gel Extraction Kit純化試劑盒為Omega公司產(chǎn)品。

1.2 方法

將含有病毒的雞胚尿囊液利用Trizol試劑提取病毒的RNA，再用M－MLV酶將所得到的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后利用針對禽流感病毒8個基因片段的特異性引物［10］進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并按照EZNA Gel Extraction Kit純化試劑盒說明書回收目的片段，送上海英濰捷基生物有限公司測序。

利用軟件 DNA Star（version 5.07，DNA Star公司，USA）和 MEGA4（version 4.0，biodesign institute of center for evolutionary functional genomics，USA）對所得到的序列和部分具有代表性的參考序列進(jìn)行分析。系統(tǒng)進(jìn)化樹是用 MEGA 4中“neighbor－joining”算法所得。用于計算核苷酸序列相似性和繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹的各基因片段見表1。

表1 3株H9N2亞型AIV分離株8個基因片段Table1 Genome profile of the 3 H9N2 isolates and gene region for phylogenetic analysis

2 結(jié)果

2.1 核苷酸序列相似性分析

應(yīng)用DNAStar軟件的Meg Align功能，將CK／GD／162／03、Francolin／GD／298／05、Ck／GD／A8／10 3個毒株各基因片段與部分具有代表性的參考毒株（圖1～圖8）進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)CK／GD／162／03毒株P(guān)B2、PB1基因與 A／Hong Kong／156／97（H5N1）相似性分別達(dá)到96.9%和96.7%，而Francolin／GD／298／05毒株M基因與 A／Hong Kong／156／97（H5N1）相似性達(dá)到96.0%；CK／GD／162／03、Francolin／GD／298／05、Ck／GD／A8／10 3 個毒株的 NP基因與 A／VN／1203／04（H5N1）的相似性最高，分別 為97.9%、97.4%、96.3%；CK／GD／162／03、Francolin／GD／298／05 2個毒株 PA 基因亦與 A／VN／1203／04（H5N1）的相似性分別達(dá)到95.6%與94.5%。其余基因均與H9N2亞型禽流感的相似性最高，其中 CK／GD／162／03 HA 基因與 Ck／BJ／1／94 的相似性最高，F(xiàn)rancolin／GD／298／05、Ck／GD／A8／10 HA基因與Dk／HK／Y280／97相似性最高，都屬于 BJ／1／94－like；CK／GD／162／03、Francolin／GD／298／05兩毒株 NA基因與Ck／SH／F／98的相似性最高，Ck／GD／A8／10 NA 基因與 Dk／HK／Y280／97相似性最高，并且Ck／GD／A8／10在62～64位缺失3個氨基酸。

2.2 遺傳進(jìn)化分析

根據(jù)H9亞型AIV HA基因和NA基因的序列特點(diǎn)，將其分為歐亞系和北美系兩個大分支。HA基因歐亞系又分為三大亞系：Y280－like，代表毒株為 Dk／HK／Y280／97或 Ck／BJ／1／94；G1－like，代表毒株為 Qa／HK／G1／97；Y439－like，代表毒株為DK／HK／Y439／97；北美型代表毒株為 Ty／Wisconsin／1／66［3，11］。NA 基因歐亞系又分為三大亞系，代表毒株分別是 Ck／HK／G9／97和 Qa／HK／G1／97，Dk／HK／Y439／97［12］。進(jìn)化分析結(jié)果表明3個毒株HA基因位于歐亞系中的Ck／Bei－like分支，而Ck／Bei－like又分為亞群Ⅰ與亞群Ⅱ兩個亞枝，其中以Dk／HK／Y280／97為代表毒株的亞群Ⅰ主要流行于雞，以Qa／ST／243／00為代表毒株的亞群Ⅱ為鵪鶉等珍禽類流行株［3，11］，本試驗分離株Francolin／GD／298／05、Ck／GD／A8／10屬于亞群Ⅰ，Ck／GD／162／03屬于亞群Ⅱ（圖1）。NA基因位于系統(tǒng)發(fā)生樹的Ck／Bei－like分支，其中CK／GD／162／03、Francolin／GD／298／05屬于 G9－like，Ck／GD／A8／10 屬于Y280－like（圖2），這個結(jié)果與 Guan［3，11］等報道的華南地區(qū)流行的H9N2亞型AIV相一致。

進(jìn)化分析結(jié)果顯示，內(nèi)部基因（PB2、PB1、PA、NP）基因來源具有多樣性，出現(xiàn)不同程度重組現(xiàn)象。Francolin／GD／298／05、Ck／GD／A8／10 PB2基因位于系統(tǒng)發(fā)生樹的SH／F／98－like分支，CK／GD／162／03 PB2基因于系統(tǒng)發(fā)生樹的G9－like分支（圖3）；CK／GD／162／03 PB1基因位于系統(tǒng)發(fā)生樹的 G1－like 分 支，F(xiàn)rancolin／GD／298／05、Ck／GD／A8／10PB1基因位于系統(tǒng)進(jìn)化樹的 BJ／1／94－like分支（圖4）；PA基因位于系統(tǒng)進(jìn)化樹的Y439－like分支，但與Y439－like分支已經(jīng)有一定的遺傳距離（圖5）；NP、NS基因均位于系統(tǒng)進(jìn)化樹的SH／F／98－like分支，但NP基因與H5N1亞型AIV在同一分支，F(xiàn)rancolin／GD／298／05、Ck／GD／A8／10 NS 基因與H6亞型 AIV在同一分支，CK／GD／162／03 NS與H5亞型AIV在同一分支（圖6和圖8）；CK／GD／162／03 M 基因位于系統(tǒng)進(jìn)化樹的 Ck／Bei－like分支，與 A／swine／Shandong／2／03（H5N1）在同一分支，F(xiàn)rancolin／GD／298／05、Ck／GD／A8／10 M 基因位于系統(tǒng)進(jìn)化樹的G1－like分支，與H6亞型AIV在同一分支（圖7）。

2.3 各基因型分子特征分析

3個分離株HA基因推導(dǎo)出的氨基酸長度均為560aa，其中包括信號肽（1 aa～18 aa）、HA1（19 aa～337 aa）和 HA2（339 aa～560 aa）3個區(qū)域，3個分離株HA裂解位點(diǎn)均為RSSR↓GLF，符合低致病性禽流感病毒的分子特征。對HA 226位受體位點(diǎn)進(jìn)行分析，CK／GD／162／03 HA蛋白的受體結(jié)合位點(diǎn)的第226位氨基酸為 Q（Gln），F(xiàn)rancolin／GD／298／05和Ck／GD／A8／10這2個毒株 HA蛋白的受體結(jié)合位點(diǎn)的第226位氨基酸均由Q（Gln）變?yōu)榱薒（Leu），使病毒由識別唾液酸α2－3（SAα2－3）受體變?yōu)樽R別哺乳動物唾液酸α2－6（SAα2－6）受體。Francolin／GD／298／05分離毒株HA上共有7個相對保守的糖基化位點(diǎn)，分別位于第29～31、218～220、305～307、551～553、141～143、298～300、492～494位氨基酸，而 CK／GD／162／03、Ck／GD／A8／10分離株在218～220位氨基酸失去一個潛在糖基化位點(diǎn)。

屬于G9－like分支的CK／GD／162／03 Francolin／GD／298／05分離株具有全長 NA（569 aa），而屬于Y280－like分支的 Ck／GD／A8／10 在 NA 頸部 區(qū) 域（62～64位）缺失3個氨基酸，但是處在Y280－like分支根部的Ck／Bei－like沒有這3個氨基酸缺失，這說明這種缺失是在進(jìn)化過程中發(fā)生的。

2.4 基因型分析

［13］對H9N2 AIV基因型分型，可將本試驗獲得的3株H9N2 AIV進(jìn)一步分為3個不同的基因型，其中 CK／GD／162／03 與 Ck／GD／A8／10的6個內(nèi)部基因中有4個基因發(fā)生重組，例如CK／GD／162／03的 PB2、PB1 來 自 于 Qa／HK／G1／97，HA、NS來自于 CK／BJ／1／94，PA 來自于 A／quail／Shantou／5663／2001，NP 來自于 CK／SH／F／98，NA來自 于 CK／HK／G9／97，故 CK／GD／162／03 屬 于B34。Francolin／GD／298／05有5個基因發(fā)生了重組。Ck／GD／A8／10與Francolin／GD／298／05的7個基因分別來自相同的分支，其PB1和NP基因來源于CK／SH／F／98；PB1和 NS基因來源于 CK／BJ／1／94；PA 基 因 來 源 于 A／quail／Shantou／5663／2001；HA 基因來源于 DK／HK／Y439／97；但 NA 不同，F(xiàn)R／GD／298／05的 NA 基 因 來 源 于 CK／HK／G9／97，CK／GD／A8／10的 NA 基因來源于 CK／BJ／1／94，故FR／GD／298／05屬于B47，CK／GD／A8／10屬于B54，具體結(jié)果見（表2、表3、圖9）。

表2 標(biāo)準(zhǔn)參考毒株基因型Table2 Genotypes of classic H9N2 reference viruses

表3 3株H9N2分離株各基因片段來源Table3 Genotype description of 3 H9N2 isolates in South China

3 討論

本試驗的3株H9N2亞型AIV分離株屬于Ck／BJ－like分支，符合我國大陸 H9N2亞型 AIV HA基因的遺傳進(jìn)化特點(diǎn)，但各基因出現(xiàn)不同程度重組現(xiàn)象。

CK／GD／162／03、 Francolin／GD／298／05 與CK／GD／A8／10分別屬于 B34、B47和 B54基因亞型，而這3個亞型是從2002年開始流行于中國大陸的，具有各基因片段高重組的特點(diǎn)，B34和B47宿主也具有多樣性，分布在雞、鴨等家禽以及鵪鶉、鷓鴣等珍禽，B54主要流行于雞［14］。從雞分離的毒株CK／GD／162／03的 HA 處在以 Qa／ST／243／00為代表毒株的亞群Ⅱ（為鵪鶉等珍禽類流行株），從中華鷓 鴣 分 離 的 Francolin／GD／298／05HA 處 在 以Dk／HK／Y280／97為代表毒株的亞群Ⅰ（主要流行于雞），也充分說明了這一點(diǎn)。Xu K M 等［11］對華南地區(qū)H9N2亞型的分子流行病學(xué)調(diào)查表明，鵪鶉可能對H9N2亞型AIV流行發(fā)揮重要作用，從以上分析推測，CK／GD／162／03分離株可能是從鵪鶉等珍禽傳播到雞群，F(xiàn)rancolin／GD／298／05分離株可能是從雞群傳播到鷓鴣等珍禽，而CK／GD／A8／10可能為雞群流行株。

Qa／HK／G1／97與CK／SH／F／98的 RNP基因可能為H5N1亞型禽流感內(nèi)部基因的供體，本試驗中3個分離株RNP基因來源于Qa／HK／G1／97與CK／SH／F／98分支，其中3個分離株的NP基因與A／VN／1203／04（H5N1）核苷酸相似性達(dá)到96.3%以上，氨基酸相似性更是高達(dá)98.8%以上，PA基因與A／VN／1203／04（H5N1）的核苷酸相似性達(dá)到94%以上，CK／GD／162／03毒株 PB2、PB1基因與A／Hong Kong／156／97（H5N1）相似性分別達(dá)到96.9%與96.7%，這說明此3個分離株內(nèi)部基因與H5N1－like毒株可能有密切的遺傳進(jìn)化關(guān)系。遺傳進(jìn)化樹顯示，3株H9N2亞型AIV分離株P(guān)B2、PB1、PA 及 M 基因遺傳演化與 H5N1、H1N1、H3N8、H4N2、H6N1、H6N2、H1N2、H3N6、H5N3、H7N1、H11N9等亞型的病毒有一定聯(lián)系，NP基因與H5N1亞型，NA基因與H6N2亞型的病毒也具有一定聯(lián)系，進(jìn)一步表明H9N2亞型AIV遺傳進(jìn)化的復(fù)雜性與多樣性，這與在中國其他地區(qū)流行的H9N2亞型 AIV 情況相一致［2，12，16－17］。

HA基因226位點(diǎn)（H3上位置）為區(qū)分人流感病毒與禽流感病毒的受體位點(diǎn)，研究表明，中國分離的H9N2亞型AIV 226L呈上升趨勢，在20世紀(jì)90年代所占比例為34.3%，在21世紀(jì)初所占比例達(dá)到76%［18－19］。Zhang等的調(diào)查結(jié)果也顯示在1998年－2003年中國流行的H9N2亞型AIV主要為226Q，在2005年－2006年［23］主要為226L。本試驗的 3 個 分 離 株 中，CK／GD／162／03 為 226Q，F(xiàn)rancolin／GD／298／05與 CK／GD／A8／10為226L，符合中國流行的H9N2亞型AIV特點(diǎn)，這提示H9N2亞型AIV有可能適應(yīng)于宿主人并且可能存在在人與人之間傳播的風(fēng)險。糖基化位點(diǎn)的突變能夠影響病毒的細(xì)胞融合能力和受體結(jié)合能力［20］，分離株HA上糖基化位點(diǎn)分析顯示，CK／GD／162／03、Ck／GD／A8／10分離株在218～220位氨基酸失去一個潛在糖基化位點(diǎn)，這種糖基化位點(diǎn)的缺失是否影響病毒的致病力，需要進(jìn)一步試驗驗證。

PA、PB1、PB2基因為流感病毒內(nèi)部基因，對其致病力有重要影響作用。研究發(fā)現(xiàn)，PB1蛋白與PA蛋白結(jié)合位點(diǎn)（1～25位氨基酸殘基）處的第13位氨基酸為Pro，與PB2蛋白結(jié)合位點(diǎn)（600～757位氨基酸殘基）處的第678位氨基酸為Asn時，能夠促進(jìn)聚合酶亞單位與NP蛋白在新宿主環(huán)境中的相互作用，通過對聚合酶活性的調(diào)控來影響流感病毒對哺乳類動物的致病性［21］。研究亦發(fā)現(xiàn)，在鴨上，PA基因在S224P與N383D發(fā)生突變時能夠增加其致病力［22］。在PB2基因，通過反向遺傳技術(shù)等已被證明K627E或D701Q或S714I（G）突變都能增強(qiáng)毒株對小鼠的致病性［23－24］，本研究毒株在這些位點(diǎn)沒有發(fā)生突變，這表明本試驗分離株可能對鴨及小鼠致病性不強(qiáng)。

PB1－F2蛋白能夠增強(qiáng) A型流感的致病性［25－26］，本研究中的3株 H9N2亞型 AIV CK／GD／162／03、Francolin／GD／298／05 及 CK／GD／A8／10所推導(dǎo)的PB1－F2氨基酸序列長度各不相同，分別為57、79與11位氨基酸，而編碼11位氨基酸的PB1－F2多見于典型豬流感HIN1，2009年流行的HIN1也都為11位氨基酸，在H9N2 AIV中不多見［27］。在 A／Vietnam／1203／04（H5N1）毒 株 上N66S突變能增強(qiáng)其對小鼠的致病性［28］，F(xiàn)rancolin／GD／298／05編碼的79位氨基酸PB1－F2上沒有N66S突變。3株H9N2亞型AIV分離株M2基因在26L、27V、30A、31S、34G、37H 或41W 都沒有發(fā)生任何氨基酸的突變，這表明所分離毒株對金剛烷胺仍然敏感［29］。

綜上所述，本研究中的3株不同年代H9N2亞型AIV分離株為重組毒株，具有來源多樣性。因此，在我國，特別是華南地區(qū)應(yīng)更加重視對H9N2亞型AIV的監(jiān)控及分子流行病學(xué)調(diào)查，防止該亞型病毒在選擇壓力下形成新的危害畜禽及公共衛(wèi)生安全的病毒。

參考文獻(xiàn)：

［1］Guo Y J，Krauss S，Senne D A，et al.Characterization of the pathogenicity of members of the newly established H9N2 influenza virus lineages in Asia［J］.Virology，2000，267（2）：279－288.

［2］Sun Y，Pu J，Jiang Z，et al.Genotypic evolution and antigenic drift of H9N2 influenza viruses in China from 1994 to 2008［J］.Vet Microbiol，2010，146（3－4）：215－225.

［3］Xu K M，Smith G J，Bahl J，et al.The genesis and evolution of H9N2 influenza viruses in poultry from southern China，2000 to 2005［J］.J Virol，2007，81（19）：10389－10401.

［4］Xu X J，Xu G Y，Zhou H B，et al.Evolutionary characterization of influenza virus A／duck／Hubei／W1／2004（H9N2）isolated from central China［J］.Virus Genes，2008，36（1）：79－83.

［5］Liu J H，Okazaki K，Shi W M，et al.Phylogenetic analysis of hemagglutinin and neuraminidase genes of H9N2 viruses isolated from migratory ducks［J］.Virus Genes，2003，27（3）：291－296.

［6］Yu H，Zhou Y J，Li G X，et al.Genetic diversity of H9N2 influenza viruses from pigs in China：a potential threat to human health？［J］.Vet Microbiol，2011，149（1－2）：254－261.

［7］Lin Y P，Shaw M，Gregory V，et al.Avian－to－h(huán)uman transmission of H9N2 subtype influenza A viruses：relationship between H9N2 and H5N1 human isolates［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2000，97（17）：9654－9658.

［8］Peiris M，Yuen K Y，Leung C W，et al.Human infection with influenza H9N2［J］.Lancet，1999，354（9182）：916－917.

［9］Guan Y，Shortridge K F，Krauss S，et al.H9N2 influenza viruses possessing H5N1－like internal genomes continue to circulate in poultry in southeastern China［J］.J Virol，2000，74（20）：9372－9380.

［10］齊 巖，袁潤余，張賀楠，等.H9N2亞型禽流感病毒廣東分離株的全基因克隆及序列分析［J］.病毒學(xué)報，2010（3）：176－182.

［11］Xu K M，Li K S，Smith G J，et al.Evolution and molecular epidemiology of H9N2 influenza A viruses from quail in southern China，2000 to 2005［J］.J Virol，2007，81（6）：2635－2645.

［12］Huang Y，Hu B，Wen X，et al.Diversified reassortant H9N2 Avian influenza viruses in chicken flocks in northern and eastern China［J］.Virus Res，2010，151（1）：26－32.

［13］Li J，Ishaq M，Prudence M，et al.Single mutation at the amino acid position 627 of PB2 that leads to increased virulence of an H5N1 avian influenza virus during adaptation in mice can be compensated by multiple mutations at other sites of PB2［J］.Virus Res，2009，144（1－2）：123－129.

［14］Dong G，Luo J，Zhang H，et al.Phylogenetic diversity and genotypical complexity of H9N2 influenza A viruses revealed by genomic sequence analysis［J］.PLoS One，2011，6（2）：e17212.

［15］Sun Y，Qin K，Wang J，et al.High genetic compatibility and increased pathogenicity of reassortants derived from avian H9N2 and pandemic H1N1／2009 influenza viruses［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2011，108（10）：4164－4169.

［16］Bi Y，Lu L，Li J，et al.Novel genetic reassortants in H9N2 influenza A viruses and their diverse pathogenicity to mice［J］.Virol J，2011，8（1）：505.

［17］Ji K，Jiang W M，Liu S，et al.Characterization of the hemagglutinin gene of subtype H9 avian influenza viruses isolated in 2007－2009 in China［J］.J Virol Methods，2010，163（2）：186－189.

［18］Lin Y P，Shaw M，Gregory V，et al.Avian－to－h(huán)uman transmission of H9N2 subtype influenza A viruses：relationship between H9N2 and H5N1 human isolates［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2000，97（17）：9654－9658.

［19］Zhang Y，Yin Y，Bi Y，et al.Molecular and antigenic characterization of H9N2 avian influenza virus isolates from chicken flocks between 1998 and 2007 in China［J］.Vet Microbiol，2011.

［20］Kaverin N V，Rudneva I A，Ilyushina N A，et al.Structural differences among hemagglutinins of influenza A virus sub－types are reflected in their antigenic architecture：analysis of H9 escape mutants［J］.J Virol，2004，78（1）：240－249.

［21］Ohtsu Y，Honda Y，Sakata Y，et al.Fine mapping of the subunit binding sites of influenza virus RNA polymerase［J］.Microbiol Immunol，2002，46（3）：167－175.

［22］Song J，F(xiàn)eng H，Xu J，et al.The PA protein directly contributes to the virulence of H5N1 avian influenza viruses in domestic ducks［J］.J Virol，2011，85（5）：2180－2188.

［23］Mok C K，Yen H L，Yu M Y，et al.Amino Acid Residues 253 and 591 of the PB2 Protein of Avian Influenza Virus A H9N2 Contribute to Mammalian Pathogenesis［J］.J Virol，2011，85（18）：9641－9645.

［24］Li Z，Chen H，Jiao P，et al.Molecular basis of replication of duck H5N1 influenza viruses in a mammalian mouse model［J］.J Virol，2005，79（18）：12058－12064.

［25］Gocnikova H，Russ G.Influenza a virus PB1－F2 protein［J］.Acta Virol，2007，51（2）：101－108.

［26］Chen W，Calvo P A，Malide D，et al.A novel influenza A virus mitochondrial protein that induces cell death［J］.Nat Med，2001，7（12）：1306－1312.

［27］Krumbholz A，Philipps A，Oehring H，et al.Current knowledge on PB1－F2 of influenza A viruses［J］.Med Microbiol Immunol，2011，200（2）：69－75.

［28］Conenello G M，Zamarin D，Perrone L A，et al.A single mutation in the PB1－F2 of H5N1（HK／97）and 1918 influenza A viruses contributes to increased virulence［J］.PLoS Pathog，2007，3（10）：1414－1421.

［29］Suzuki H，Saito R，Masuda H，et al.Emergence of amantadine－resistant influenza A viruses：epidemiological study［J］.J Infect Chemother，2003，9（3）：195－200.