郭志云，楊 光，荊春霞，付芹芹，孫小會(huì)，王穗湘，李月琴，周天鴻

隱孢子蟲（Cr yptosporidiu m spp．）是一種呈世界性分布的人獸共患寄生蟲，已成為世界范圍內(nèi)水源傳播疾病中的重要病原體，它能感染人和許多動(dòng)物，嚴(yán)重危害著人類的健康和畜牧業(yè)的發(fā)展［1］。隱孢子蟲機(jī)會(huì)性感染是AIDS病患者的重要致死原因，而目前還沒有有效的治療和預(yù)防方法［2］。近幾年，隨著全基因組測(cè)序計(jì)劃的不斷發(fā)展，隱孢子蟲已有3個(gè)分離株（C．parvu m Iowa II，C．hominis TU502和C．muris）的全基因組測(cè)序工作完成［3－4］，圍繞隱孢子蟲基因結(jié)構(gòu)和功能的研究迅速成為熱點(diǎn)。

EF－h(huán)and （Exchange Factor hand）結(jié) 構(gòu) 域（PROSITE entry：PDOC00018，Ex PASy）是一種含有鈣離子結(jié)合位點(diǎn)的α螺旋－中央環(huán)－α螺旋（alpha helix－loop－alpha helix）結(jié)構(gòu)，兩股α螺旋分別稱為“E”和“F”，且?guī)缀跏谴怪钡?，這有利于中央環(huán)與Ca2＋結(jié)合而發(fā)生構(gòu)象的改變，進(jìn)而暴露靶結(jié)合位點(diǎn)而發(fā)揮生物學(xué)功能［5－6］。EF－h(huán)and motif約含有 40個(gè)氨基酸殘基，常以成對(duì)形式出現(xiàn)在蛋白功能域中，與重要的鈣離子信號(hào)有著密切的關(guān)系［7］。

我們?cè)趯?duì)隱孢子蟲進(jìn)行基因功能研究的過程中，發(fā)現(xiàn)C．par vu m Iowa II基因組中含有大量EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域蛋白。為了更好地分析這類含有EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域的蛋白的功能及其對(duì)微小隱孢子蟲的重要意義，本文對(duì)微小隱孢子蟲該蛋白家族進(jìn)行了生物信息學(xué)相關(guān)分析，為進(jìn)一步基因功能研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 數(shù)據(jù)收集 在美國隱孢子蟲基因組數(shù)據(jù)庫（htt p：／／cr yptodb．or g／cr yptodb／）中 “Gene Text Search”信息欄輸入EF－h(huán)and，初步搜索C．par vu m Iowa II基因組中推定的含有EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域的蛋白，結(jié)合 Gen Bank中的核酸數(shù)據(jù)庫（http：／／www．ncbi．nl m．nih．gov／）獲得各蛋白相應(yīng)的核苷酸序列及蛋白序列。

1．2 結(jié)構(gòu)域和motif分析 將搜索獲得的蛋白序列輸入到NCBI的結(jié)構(gòu)域搜索網(wǎng)站CDD（http：／／www．ncbi．nl m．nih．gov／Str ucture／cdd／wrpsb．cgi）中進(jìn)行各蛋白的結(jié)構(gòu)域搜索，以進(jìn)一步確定和分析各蛋白含有EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域以及其他結(jié)構(gòu)域的情況。同時(shí)還進(jìn)行Sanger網(wǎng)站的Pfam搜索（http：／／pf am．sanger．a(chǎn)c．uk／）驗(yàn)證結(jié)構(gòu)域搜索結(jié)果。通過日本京都大學(xué)開發(fā)的Motif Search在線搜索工具（http：／／www．geno me．jp／tools／motif／），對(duì)每個(gè)蛋白進(jìn)行了motif搜索。

1．3 序列比對(duì) 利用NCBI BLAST功能中的Blast－N和Blast－P對(duì)經(jīng)過結(jié)構(gòu)域搜索確定含有EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域的蛋白進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列比對(duì)，以確保所收集得到的數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。在缺省值條件下使用Cl ustal W軟件（版本號(hào)是1．83）對(duì)每個(gè)蛋白的EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域進(jìn)行多序列聯(lián)配分析，以進(jìn)一步了解微小隱孢子蟲中EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域間的相似性和研究EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域中的Ca2＋binding site等重要?dú)埢嚓P(guān)信息。

1．4 計(jì)算蛋白的分子量、等電點(diǎn)和氨基酸長度 將目的蛋白序列輸入到 Ex PASy（http：／／www．expasy．ch／t ools／pi＿tool．ht ml）進(jìn)行蛋白的分子量和等電點(diǎn)計(jì)算，以比較EF－h(huán)and家族蛋白之間基本性質(zhì)的區(qū)別。

1．5 蛋白功能分析 通過各蛋白所含有的結(jié)構(gòu)域情況，對(duì)C．par vum Iowa II中的 EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域蛋白進(jìn)行大致分類。利用結(jié)構(gòu)域畫圖軟件DOG 2．0（Do main Graph，version 2．0，（Do main Graph，version 2．0，http：／／dog．biocuckoo．org／soft ware．php）畫出上述蛋白所含有的結(jié)構(gòu)域以及鈣離子結(jié)合位點(diǎn)和其他相關(guān)重要位點(diǎn)情況，進(jìn)行蛋白之間的比較與分析，最后結(jié)合NCBI的Blast比對(duì)結(jié)果和文獻(xiàn)分析進(jìn)行功能預(yù)測(cè)。

2 結(jié) 果

2．1 含EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域蛋白的初篩 在微小隱孢子蟲基因組數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)收集過程中，在C．parvum Iowa II的全基因組中搜索獲得數(shù)據(jù)庫中注釋的含有EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域的53個(gè)蛋白，經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)其中15個(gè)蛋白是假設(shè)蛋白，故將獲得的除去假設(shè)蛋白的38個(gè)含EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域的蛋白作為進(jìn)一步分析的目標(biāo)蛋白。

2．2 含EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域蛋白的確定 將這38個(gè)蛋白的蛋白序列輸入到NCBI的結(jié)構(gòu)域搜索網(wǎng)站中進(jìn)行CDD結(jié)構(gòu)域搜索與分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)這38個(gè)蛋白中只有18個(gè)蛋白真正含有EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域，其余20個(gè)蛋白均未發(fā)現(xiàn)EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域的存在。將此未發(fā)現(xiàn)EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域的20個(gè)蛋白序列輸入到sanger網(wǎng)站進(jìn)行Pfam結(jié)構(gòu)域搜索，結(jié)果仍未搜索到EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域，推測(cè)在微小隱孢子蟲基因組數(shù)據(jù)庫中的全基因組進(jìn)行注釋時(shí)并未精確分類這些蛋白。因此對(duì)這18個(gè)真正含有EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域的蛋白進(jìn)行深入分析（表1）。

2．3 蛋白的基本性質(zhì)分析 經(jīng)過Ex PASy的分子量和等電點(diǎn)分析，這18個(gè)蛋白之間的氨基酸長度、分子量大小以及等電點(diǎn)等都有很大的區(qū)別，它們的氨基酸長度從149－1042 AA，分子量從16．8－115．6k D，pI值從4．09－8．96，呈現(xiàn)著明顯的區(qū)別。EF－h(huán)and家族的染色體定位分析表明，該家族蛋白分布在C．par vu m Iowa II的1、2、3、5、7與8號(hào)染色體上，其中在3號(hào)染色體上1個(gè)，1號(hào)染色體上有2個(gè)，5號(hào)、7號(hào)和8號(hào)染色體上各有3個(gè)，分布最多的是2號(hào)染色體6個(gè)，4號(hào)和6號(hào)染色體上未發(fā)現(xiàn)此類蛋白的存在。而且，除cgd1－1370含有1個(gè)內(nèi)含子之外，其余17個(gè)蛋白未見內(nèi)含子的存在（表1）。

2．4 結(jié)構(gòu)域和motif分析 通過CDD結(jié)構(gòu)域搜索發(fā)現(xiàn)，在這18個(gè)蛋白中，有9個(gè)蛋白含有2個(gè)EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域，分別為cgd2－810、cgd8－1280、cgd5－60、cgd1－1370、cgd8－4120、cgd2－1240、cgd5－820、cgd7－1840和cgd2－1300。而另外9個(gè)蛋白只含有1個(gè) EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域，分別是cgd2－1700、cgd8－500、cgd5－3920、cgd3－3420、cgd2－3990、cgd1－3220、cgd7－40、cgd2－1060和cgd7－1260。除 EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域外，cgd5－820、cgd7－1260 和 cgd2－1300還含有PKC（protein kinase C）結(jié)構(gòu)域，cgd2－1060和 cgd7－1840 還 含 有 STKc－AGC〔serine／t hreonine kinases（STKs），AGC （pr otein kinases A，G and C f amily，catal ytic do main〕結(jié)構(gòu)域，且cgd7－1840還含有一個(gè)CBM20（The fa mil y 20 carbohydrate－binding module，also known as the starch－binding domain）結(jié)構(gòu)域（圖1）。

表1 微小隱孢子蟲基因組中含有EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域的18種蛋白的基本信息Tab．1 General infor mation about the 18 kinds of pr otein which containd EF－h(huán)and domains of the C．parvum Iowa II genome

圖1 微小隱孢子蟲含有EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域蛋白的結(jié)構(gòu)域示意圖Fig．1 The domain condition of the 18 proteins containing EF－h(huán)and domains from the C．parvum Iowa IINote：This result was obtained in March 2011 online．Due to the update of the website，there is a certain difference in the results bet ween before and after search．EFh：EF－h(huán)and domain；EH：Eps15 homology domain（EFh superfamily）．

經(jīng)motif搜索發(fā)現(xiàn)，18個(gè)蛋白都含有EF－h(huán)and－1 Motif，其一致模式為D－｛W｝－［DNS］－｛ILVFY W ｝－［DENSTG ］－［DNQGHRK ］－｛GP ｝－［LIV MC］－［DENQSTAGC］－x（2）－［DE］－［LIVMFY W］（PROSITE entr y：PS00018；“｛｝”表示除了括號(hào)內(nèi)的任何一個(gè)氨基酸都可以，“［］”表示括號(hào)內(nèi)的任何一個(gè)氨基酸都可以，“x”表示所有氨基酸中的任何一個(gè)，“x（2）”表示此位點(diǎn)兩個(gè)重復(fù)氨基酸，“－”為分隔符），包括了13個(gè)氨基酸殘基，其中，位點(diǎn)1、3、5、7、9和12（圖2）都是和Ca2＋結(jié)合相關(guān)的重要位點(diǎn)，尤其是位點(diǎn)12上固定不變的帶負(fù)電荷的Asp（D）或Glu（E）可以通過電荷之間的相互作用與帶正電荷的Ca2＋結(jié)合，并提供2個(gè)氧給Ca2＋以促進(jìn)Ca2＋的 結(jié) 合 （http：／／pfam．sanger．a(chǎn)c．uk／family／PF00036．26）。通過 Clustal W 1．83軟件進(jìn)行的EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域多序列聯(lián)配分析發(fā)現(xiàn)，本文所分析的18個(gè)蛋白的EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域均由一對(duì)EF－h(huán)and motif構(gòu)成，都符合EF－h(huán)and－1 Motif的一致模式，其中位點(diǎn)1上幾乎均為D（Asp）氨基酸，位點(diǎn)12上幾乎都是E（Glu）和D（Asp）氨基酸（圖2），這就揭示了EF－h(huán)and motif在氨基酸序列上的保守性，進(jìn)一步說明這些位點(diǎn)是結(jié)構(gòu)域的重要位點(diǎn)。

還發(fā)現(xiàn)，cgd2－3990的羧基末端還含有一個(gè)ER－TARGET motif （endoplas mic reticulu m－targeting signal sequence）RDE，稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）滯留信號(hào)的4肽信號(hào)序列，它的一致模式為［KRHQ－SA］－［DENQ］－E－L（PROSITE：PS00014），帶 有 此滯留信號(hào)的蛋白被稱為ER定居蛋白，在ER腔、高爾基體及其中間區(qū)分布有ER－TARGET motif的受體，ER定居蛋白一旦進(jìn)入高爾基體就會(huì)被高爾基體上的受體結(jié)合，形成回流小泡被轉(zhuǎn)運(yùn)回內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，從而將錯(cuò)誤轉(zhuǎn)運(yùn)到分泌囊泡中的ER定居蛋白重新轉(zhuǎn)運(yùn)回ER腔［8］。此外cgd5－820、cgd7－1840、cgd2－1300、cgd2－1060、cgd7－40和cgd7－1260這6個(gè)蛋白都含有一個(gè)PROTEIN＿KINASE＿ST motif（PROSITE：PS00108）和一個(gè)PROTEIN＿KINASE＿ATP motif（PROSITE：PS00107）。PROTEIN＿KINASE＿ST motif是一個(gè) Serine／Threonine protein kinases active－site signat ure，而 PROTEIN＿KINASE＿ATP motif是一個(gè)Pr otein kinases ATP－binding region signature，除 cgd7－40 之外，這些motif剛好是和它們所含有的PKc或STKc－AGC蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域相一致的。因此，我們可以發(fā)現(xiàn)，motif和domain雖然是兩個(gè)不同的概念，但是兩者之間是密切相關(guān)的，正是因?yàn)閙otif這些保守性的殘基組成了do main。

圖2 微小隱孢子蟲18個(gè)蛋白的EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域多序列聯(lián)配分析Fig．2 Multiple sequence align ment of the EF－h(huán)and domain from the 18 proteins of the C．parvum Iowa IINote：The domain sequence is named according to the complete genome database’s gene names；the 1 and 2 represent t his pr otein’s t wo EF－h(huán)and do mains．

2．5 蛋白分類情況 PKC結(jié)構(gòu)域是蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域（protein kinases catalytic domain），能夠催化ATP上的γ－磷酰基團(tuán)向蛋白底物的絲氨酸／蘇氨酸／酪氨酸殘基轉(zhuǎn)移，使絲氨酸／蘇氨酸／酪氨酸被磷酸化；而STKc－AGC結(jié)構(gòu)域?yàn)榻z氨酸／蘇氨酸激酶 （serine／t hreonine kinases，STKs）－蛋白激酶 A、G、C 家族 （protein kinases A，G，and C family，AGC）催化結(jié)構(gòu)域，是蛋白激酶超家族中A、G、C家族的絲氨酸／蘇氨酸激酶催化結(jié)構(gòu)域，只能催化ATP上的γ－磷酰基團(tuán)向蛋白底物的絲氨酸／蘇氨酸殘基的轉(zhuǎn)移，使絲氨酸／蘇氨酸發(fā)生磷酸化（http：／／www．ncbi．nl m．nih．gov／Str ucture／cdd／cddsrv．cgi）；而成對(duì)出現(xiàn)的EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域會(huì)比單一EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域更穩(wěn)定，且在對(duì)Ca2＋的結(jié)合上起著協(xié)同作用［9］。因此基于所含有的結(jié)構(gòu)域情況可以簡單地把這18個(gè)蛋白分成a、b、c和d四大類（見圖1）：a類為只含有1個(gè)EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域的蛋白，b類為只含有2個(gè)EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域的，c類為同時(shí)含EF－h(huán)and和STKc－AGC兩種結(jié)構(gòu)域的，d類為同時(shí)含EF－h(huán)and和PKC兩種結(jié)構(gòu)域的蛋白。

3 討 論

自從微小隱孢子蟲（C．par vu m）8條染色體的全基因測(cè)序工作［3－4］完成之后，隱孢子蟲的研究已進(jìn)入了后基因組時(shí)代，大量新基因的發(fā)現(xiàn)為科研工作者提供了更多的研究方向。其中許多的序列信息只進(jìn)行了簡單的注釋，利用生物信息學(xué)相關(guān)知識(shí)來分析和預(yù)測(cè)蛋白的功能已成為很多課題研究的基礎(chǔ)。本研究從與蛋白功能密切相關(guān)的結(jié)構(gòu)域信息出發(fā)，通過研究隱孢子蟲中EF－h(huán)and家族蛋白的結(jié)構(gòu)域情況去預(yù)測(cè)這些蛋白的功能，為后續(xù)進(jìn)行的微小隱孢子蟲中鈣離子代謝的研究提供了更多的方向。

Ca2＋信號(hào)是真核細(xì)胞中最廣泛存在的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制之一，細(xì)胞受到刺激后，儲(chǔ)存的Ca2＋就會(huì)被快速釋放，引起下游一系列的效應(yīng)，而這些效應(yīng)一般由EF－h(huán)and蛋白超家族通過各種途徑參與執(zhí)行［10］。EF－h(huán)and蛋白是一類同源蛋白，一般含有2到12個(gè)拷貝的EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域，按功能可以分為兩類，一類為結(jié)合Ca2＋后能發(fā)生構(gòu)象改變起到調(diào)控作用的信號(hào)蛋白，包括鈣調(diào)蛋白（cal modulin）、肌鈣蛋白C（tr oponin C）和S100B蛋白等；另一類為如鈣結(jié)合蛋白（calbindin）和小清蛋白（Parvalbu min）樣只起到緩沖胞內(nèi)Ca2＋水平的結(jié)構(gòu)蛋白，它們不會(huì)發(fā)生Ca2＋依賴的構(gòu)象改變［11］。對(duì)于本研究中的這18個(gè)蛋白，基于美國隱孢子蟲基因組數(shù)據(jù)庫的注釋和同源性分析，cgd2－810、cgd2－1700、cgd5－3920 和cgd3－3420屬于鈣調(diào)蛋白家族，因此它們屬于起到調(diào)控作用的信號(hào)蛋白；cgd8－500、cgd8－1280、cgd5－60和cgd8－4120屬于中心體蛋白家族（centrin，在某些生物又叫做鈣牽蛋白，caltractin），centrins在結(jié)合Ca2＋之后發(fā)生的構(gòu)象改變，很有可能為紡錘極體（spindle pole body）的復(fù)制提供信號(hào)，并提高了centrins對(duì)相互作用的目的蛋白的親和力［12］，因此這類蛋白應(yīng)該都屬于信號(hào)蛋白；而cgd5－820、cgd7－1840、cgd2－1300、cgd2－1060、cgd7－40和cgd7－1260都屬于CDPK （calciu m／cal modulin－dependent protein kinase）蛋白，由于 EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域和protein kinase結(jié)構(gòu)域之間存在信息傳遞關(guān)系，也應(yīng)都屬于信號(hào)蛋白；cgd1－1370是磷酸酶B亞單位（calcineurin subunit B，Cn B），雖然在結(jié)合Ca2＋之后并不經(jīng)歷Ca2＋誘導(dǎo)的構(gòu)象改變，但它是一個(gè)獨(dú)立的Ca2＋傳感器，能夠調(diào)控Ca2＋依賴的和非Ca2＋依賴的兩種形式磷酸酶［13］，所以是一個(gè)信號(hào)蛋白；cgd2－1240和cgd1－3220，目前尚無相關(guān)功能研究的資料支撐其分類；cgd2－3990是一個(gè)膜相關(guān)的Ca2＋依賴的ER定居蛋白，與Pl asmodiu m f alcipar u m的Pfs40蛋白結(jié)構(gòu)非常相似，而Pfs40是Pl asmodium f alcipar um 配子主要的Ca2＋結(jié)合蛋白，Ca2＋調(diào)控的結(jié)構(gòu)改變很有可能是其細(xì)胞識(shí)別和聚合所必須的分子相互作用［14］，所以cgd2－3990也是一個(gè)信號(hào)分子。因此，我們推測(cè)，此EF－h(huán)and家族除cgd2－1240和cgd1－3220尚未有相關(guān)資料來支撐分類之外，其余的16個(gè)蛋白都屬于信號(hào)蛋白，但這只是基于生物信息學(xué)的初步分類，而進(jìn)一步的確定還需要對(duì)各個(gè)蛋白進(jìn)行如Ca2＋放射自顯影等相關(guān)的體外實(shí)驗(yàn)來說明。

Ca2＋信號(hào)控制著頂復(fù)門寄生蟲生活史中很多重要的過程，如粘附素的分泌、蟲體的滑行運(yùn)動(dòng)、對(duì)宿主細(xì)胞的入侵和逃出等，而蛋白激酶是下游Ca2＋水平變化的效應(yīng)器，Ca2＋向胞質(zhì)的快速釋放將會(huì)活化Ca2＋依賴的蛋白激酶家族（CDPKs）［15］。在植物和一些原生動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)，CDPKs能夠接收Ca2＋信號(hào)而在細(xì)胞中扮演著非常重要的角色，經(jīng)典的CDPKs結(jié)構(gòu)域含有一個(gè)能對(duì)靶蛋白進(jìn)行磷酸化作用的激酶催化區(qū)（kinase catalytic region）和大量的C末端EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域（通常為4個(gè)EF－h(huán)and motifs），它們中間是一個(gè)短的自動(dòng)抑制結(jié)構(gòu)域，正常情況下，這個(gè)自動(dòng)抑制結(jié)構(gòu)域充當(dāng)假底物的身份，和蛋白激酶結(jié)構(gòu)域結(jié)合在一起從而抑制蛋白激酶結(jié)構(gòu)域的功能，當(dāng)Ca2＋結(jié)合到EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域之后，這種自動(dòng)抑制作用就會(huì)被解除，從而發(fā)揮Ca2＋依賴的蛋白激酶家族蛋白各種功能［16－17］。本文中含有CDPKs結(jié)構(gòu)域（PKc和STKc－AGC）的5個(gè) EF－h(huán)and蛋白中，有3個(gè)蛋白在蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域后面緊跟著2個(gè) EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域即4個(gè) EF－h(huán)and motifs，且PKc和STKc－AGC結(jié)構(gòu)域都具有活化位點(diǎn)（active site）、ATP結(jié)合位點(diǎn)（ATP binding site）以及底物結(jié)合位點(diǎn)（substrate binding site）。CDPKs作為一切生命活動(dòng)的基礎(chǔ)，控制著細(xì)胞內(nèi)如轉(zhuǎn)錄、新陳代謝、離子泵與離子通道和細(xì)胞骨架的構(gòu)建等一系列的過程［18］，所以在C．par vu m Iowa II中應(yīng)該是這類EF－h(huán)and家族蛋白起著最重要的作用，且它們這種強(qiáng)大功能的發(fā)揮是依賴于這些蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域的。

大量的研究還證明，Ca2＋調(diào)控著瘧原蟲不同的生物過程，如裂殖子對(duì)紅細(xì)胞的入侵，動(dòng)合子和子孢子的運(yùn)動(dòng)與細(xì)胞侵襲，分泌細(xì)胞器的脫落，以及在蚊體內(nèi)的性分化過程［19－20］。Toxopl asma gondii 的體外試驗(yàn)也證明，寄生蟲侵入宿主細(xì)胞前的細(xì)胞附著作用是與頂復(fù)門特有的微線體黏附蛋白（micr oneme proteins）密切相關(guān)的，而微線體黏附蛋白的分泌又受到胞質(zhì)Ca2＋水平的調(diào)控［15］。還有實(shí)驗(yàn)證明，C．par vu m子孢子侵入宿主細(xì)胞之前需要進(jìn)行Ca2＋依賴的頂復(fù)器的脫落是［20］，因此C．parvu m對(duì)宿主細(xì)胞的侵襲與胞內(nèi)的Ca2＋信號(hào)有著非常重要的關(guān)系。在隱孢子蟲基因組中EF－h(huán)and蛋白家族如此地龐大，暗示著鈣離子信號(hào)在隱孢子蟲的整個(gè)生命活動(dòng)中起著非常重要的作用，EF－h(huán)and蛋白很有可能成為今后隱孢子蟲病治療的一個(gè)藥物靶點(diǎn)。鑒于本文前面的討論，cgd5－820、cgd7－1840、cgd2－1300、cgd2－1060、cgd7－1260、cgd1－1370和cgd2－3990這7個(gè)蛋白很有可能在隱孢子蟲的生活史中起著關(guān)鍵的作用。尤其是cgd2－3990和cgd1－1370兩個(gè)蛋白，cgd2－3990很有可能與隱孢子蟲配子體的形成和作用有著密切的關(guān)系［14］，而cgd1－1370作為Calcineurin的一個(gè)調(diào)節(jié)亞基，且已有研究證明Calcineurin B對(duì)免疫系統(tǒng)有明顯的刺激作用，是T細(xì)胞的活化過程必不可少的，在老鼠身上也證明了Calcineurin B的顯著抗癌效應(yīng)，所以cgd1－1370很有可能成為隱孢子蟲病治療的藥物靶點(diǎn)［13］，這7個(gè)蛋白將會(huì)成為今后深入研究的方向。

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