佘俊萍，張錫林，王光西，孫 源，王利芳，胡朝惠

蠕形螨寄生于人和哺乳動(dòng)物的毛囊和皮脂腺內(nèi)，已知有140余種和亞種，寄生于人體的主要有毛囊蠕形螨（Demodex f olliculorum）和皮脂腺蠕形螨（Demodex brevis）兩種，感染以毛囊蠕形螨為主［1］。國(guó)內(nèi)人群感染率在0．8%～81%［2］，以顏面、鼻唇溝［3］，額，眼瞼和胸背等部位多見(jiàn)，臨床常導(dǎo)致皮膚瘙癢、丘疹、脂溢性皮炎、痤瘡、酒渣鼻等。毛囊蠕形螨個(gè)體微?。?00～400μm），比重輕、透明且脆弱，體表附厚重皮脂，這些因素成為研究其形態(tài)、結(jié)構(gòu)及其生物學(xué)功能等特性的瓶頸。徐蔭祺［4］、丁曉昆［5］曾用普通掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）對(duì)人體蠕形螨進(jìn)行觀察，近年，趙巖等［6］、劉瑩等［7］、馮新玉等［8］也通過(guò)掃描電鏡對(duì)人體蠕形螨超微形態(tài)進(jìn)行了補(bǔ)充研究，但均對(duì)一些具分類、功能意義的結(jié)構(gòu)觀察還不夠，影響了蟲(chóng)種鑒別及致病機(jī)制的研究。

激光掃描共聚顯微鏡（confocal laser scanning microscope，CLSM）的工作原理是在熒光顯微鏡成象的基礎(chǔ)上，利用共聚焦光路和激光掃描獲得樣品的顯微圖像，經(jīng)過(guò)計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖象處理，獲得細(xì)胞或組織內(nèi)部結(jié)構(gòu)的熒光圖像。激光掃描共聚焦顯微鏡具有高靈敏度和能觀察空間結(jié)構(gòu)的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，從而對(duì)被檢樣品從停留在表面、單層、靜態(tài)局面的觀察進(jìn)展到立體、斷層掃描、動(dòng)態(tài)全面的觀察，并已在生命科學(xué)研究中得迅速的應(yīng)用，為該領(lǐng)域新一代強(qiáng)有力的研究工具。本實(shí)驗(yàn)采用CLSM對(duì)人體毛囊蠕形螨進(jìn)行三維形態(tài)學(xué)觀察，嘗試觀測(cè)蟲(chóng)體的進(jìn)一步形態(tài)和結(jié)構(gòu)。

1 材料和方法

1．1 取材方法 在瀘州醫(yī)院附院皮膚科采集患者鼻部皮脂，采用自制刮取式取螨器、挑螨針作為取螨工具，以早先建立的方法［9］，選用2% （安利）餐具洗潔精作為皮脂、脂肪溶解劑，用凹玻片作為清洗容器，從受檢者皮脂分泌物中快速分出清潔的活毛囊螨置于1．5 mL離心管中，50支／管，75%酒精固定，－4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2 實(shí)驗(yàn) 激光共聚焦顯微鏡為L(zhǎng)eica TCS SPE，5810R／5804R冷凍離心機(jī)為 Gene Company Li mited，碘化丙啶（propidiu m iodide，PI）購(gòu)自Sigma公司，異硫氰酸 （fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC），購(gòu)自美國(guó)Bio Legend公司，2．5%戊二醛等其他試劑購(gòu)自上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1．3 實(shí)驗(yàn)方法 將盛有毛囊螨的離心管離心30 s，1 000 r／min棄上清，吸取管底的毛囊蠕形螨均勻涂在用多聚賴氨酸處理過(guò)的玻片中央進(jìn)行固定，待酒精揮發(fā)后，滴加用PBS稀釋10倍的FITC進(jìn)行初染，37℃，恒溫培養(yǎng)箱孵育2 h，用0．01 mol／L的PBS洗滌2次，5 min／次，再滴加5μg／ml PI室溫避光15 min復(fù)染，用0．01 mol／L的PBS洗滌4次，5 min／次。稍晾干后，滴加80%甘油封片蓋上蓋玻片，用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察，選取蟲(chóng)體不同部位、不同角度、不同層面進(jìn)行連續(xù)光學(xué)切片，并使用Imaris 5．0軟件進(jìn)行三維重建。

2 結(jié) 果

2．1 激光掃描共聚焦顯微鏡連續(xù)光學(xué)切片激光掃描共聚焦顯微鏡以每0．2μm厚度對(duì)完整蟲(chóng)體進(jìn)行從上到下連續(xù)光學(xué)切片，獲得到45張圖片（圖1）。

圖1 激光掃描共聚焦顯微鏡下蟲(chóng)體連續(xù)光學(xué)切片F(xiàn)ig．1 Serial optical sections of DF by CLSM

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，蟲(chóng)體與FITC和PI均有很強(qiáng)的結(jié)合力。在激發(fā)光下，熒光信號(hào)將蟲(chóng)體形態(tài)清晰的展現(xiàn)出來(lái)。蟲(chóng)體蛋白與FITC結(jié)合在激發(fā)光束的作用下發(fā)出綠色熒光，蟲(chóng)體細(xì)胞核與PI結(jié)合后在在激發(fā)光束的作用下發(fā)出紅色熒光。清晰可見(jiàn)毛囊蠕形螨的細(xì)微結(jié)構(gòu)，比單純使用PI或FITC染色效果更佳。選取蟲(chóng)體不同部位、角度、不同層面進(jìn)行斷層掃描，并使用Imaris5－0－1w軟件進(jìn)行了三維圖象的構(gòu)建。2．2 主要三維形態(tài)特征 蟲(chóng)體呈蠕蟲(chóng)狀，半透明，左右對(duì)稱，腹面扁平，背面隆起，長(zhǎng)約0．25 m，寬約0．05 mm（圖2），厚約0．02 mm（圖5、6），分顎體、足體和末體三部分（圖2）。顎體扁平，呈對(duì)稱五邊形，（圖3、4、5），前端略窄（圖5），位于軀體最前端，伸出的一對(duì)突出物，是蟲(chóng)體的基內(nèi)葉（basendite），顎體背面前端有一對(duì)呈雙葉形短鉚狀的背基刺（supraeoxals spine），以柄著生于基部的陷窩內(nèi)，推測(cè)為一種感覺(jué)器官，它對(duì)蠕形螨的種類鑒別上有一定意義。第一對(duì)足體中部見(jiàn)馬蹄形咽泡（pharyngeal bul b），為分類的特征型結(jié)構(gòu)（圖4）。顎體背面的中部有一針狀的錐狀突（圖5），向前伸出，其前端被顎體腹面的口下板延伸的膜狀結(jié)構(gòu)所包繞，形成短喙?fàn)?。顎體背面中部見(jiàn)一對(duì)對(duì)稱紅染的結(jié)構(gòu)為“眼點(diǎn)”（eyespot），推測(cè)為感覺(jué)乳突，主要感受溫度和光的刺激（圖3）。自足體起，至第3對(duì)足蟲(chóng)體厚度開(kāi)始逐漸達(dá)到至最厚（圖5），足4對(duì)，粗短呈芽突狀，足基節(jié)與軀體愈合成基節(jié)板，單個(gè)足呈圓錐形，套筒狀，結(jié)構(gòu)相似，每足分4節(jié)，粗壯（圖3、4）。陰門(mén)在第四對(duì)足基節(jié)片之間的后方，為一圓形開(kāi)口（圖2、4、6）。毛囊螨末體細(xì)長(zhǎng)如指狀，約占蟲(chóng)體全長(zhǎng)的3／4，尾部鈍圓，體表覆有明顯環(huán)形橫紋，似“同心圓”樣，突出體表，未見(jiàn)排泄孔道圖（圖2）。

特別是此次見(jiàn)到毛囊螨的上消化道，染色后呈紅色，從鄂體最前端中央出現(xiàn)一根管道狀結(jié)構(gòu)，到鄂體中部開(kāi)始分為左右兩支，并延伸到第一對(duì)足中部，呈現(xiàn)倒置“Y”字形，推測(cè)為染料從毛囊螨“口前腔”浸入消化道所至（圖3）。

圖2 毛囊蠕形螨全蟲(chóng)形態(tài)Fig．2 Three－di mensional reconstr uction of DF

3 討 論

激光掃描共聚焦顯微鏡是目前生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中最先進(jìn)的熒光成像和細(xì)胞分析工具之一。可對(duì)標(biāo)本各深度層面的信息進(jìn)行三維重建，從而得到表面及內(nèi)部結(jié)構(gòu)都非常清晰的三維圖像。異硫氰酸（fl uorescein isot hiocyanate，F(xiàn)ITC）是目前應(yīng)用最廣泛的熒光素，其有兩種異構(gòu)體，其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性與蛋白質(zhì)結(jié)合力等方面都更優(yōu)良。碘化丙啶（pr opidine iodide，PI）是一種標(biāo)記細(xì)胞核的核酸染料，它是一種靈敏的細(xì)胞化學(xué)熒光探針，能夠透過(guò)細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染［10］。將毛囊螨用FITC初染，再用PI復(fù)染后置于激光共聚焦顯微鏡下觀察：蟲(chóng)體與兩種熒光染料結(jié)合充分，蟲(chóng)體蛋白與FITC結(jié)合后在激發(fā)光束作用下發(fā)出綠色熒光，蟲(chóng)體細(xì)胞核與PI結(jié)合后發(fā)出紅色熒光。將所獲連續(xù)光學(xué)切片用Imaris5－0－1 w軟件進(jìn)行三維重建，可在三維空間中隨意拖動(dòng)蟲(chóng)體各角度觀測(cè)其結(jié)構(gòu)。

本研究旨在通過(guò)三維形態(tài)的研究探討蟲(chóng)體各結(jié)構(gòu)的功能。蟲(chóng)體圖像十分清晰，色彩鮮明，特別是“咽泡”“眼點(diǎn)”“基節(jié)片”、“足”和“陰門(mén)”等結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)，顎體呈“對(duì)稱五邊形”（圖3），與以往描述的呈“不規(guī)則四邊形”或“梯形”略有不同，顎體基部尖細(xì)，此特點(diǎn)利于的擺動(dòng)。同時(shí)可見(jiàn)蟲(chóng)體顎體背面中間有左右對(duì)稱排列的一對(duì)類似“眼睛”的結(jié)構(gòu)，突出于蟲(chóng)體體表，以往資料極少有提及也未詳細(xì)描述過(guò)，推測(cè)該結(jié)構(gòu)為蟲(chóng)體的一種感覺(jué)器官，主要感受溫度和光的刺激，也可能是原生動(dòng)物和低等無(wú)脊椎動(dòng)物的小形而構(gòu)造簡(jiǎn)單的視覺(jué)器官，且稱“眼點(diǎn)”（eyespot）或感覺(jué)乳突。Desch（1970）［12］曾通過(guò)光鏡和電鏡研究發(fā)現(xiàn)：毛囊螨口前腔底部后方有一短小食管，并從口前腔底部開(kāi)始彎曲向下通至杯形的“咽泵”，食管腔形狀可隨進(jìn)食時(shí)壓力變化而發(fā)生改變，直徑僅一個(gè)微米，認(rèn)為蠕形螨進(jìn)食的是液體食物。由此，推測(cè)見(jiàn)到的倒置的“Y”字形的結(jié)構(gòu)應(yīng)該為攝食通道，應(yīng)為“口前腔”經(jīng)“食管”到“咽泵”部分。本實(shí)驗(yàn)中清晰見(jiàn)到陰門(mén)呈“近圓形”，與李朝品（2006）［11］指出陰門(mén)為一“狹長(zhǎng)縱裂狀開(kāi)口”略有不同，我們也曾經(jīng)觀察到陰門(mén)呈“狹長(zhǎng)縱裂狀開(kāi)口”和“近圓形”的情況，這可能是雌性生殖器的個(gè)體形態(tài)差異或是其在繁殖期及交配期形態(tài)發(fā)生改變。

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