張靜 王玲玲

(陜西師范大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院 陜西西安 710062)

在武漢大學(xué)主編的《分析化學(xué)》(第4版)中增加了固相萃取和固相微萃取的內(nèi)容，但在分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)課的內(nèi)容中，實(shí)驗(yàn)對(duì)象多為簡(jiǎn)單樣品，多數(shù)情況下學(xué)生不需要進(jìn)行復(fù)雜的樣品前處理就可以直接進(jìn)行測(cè)定。因此，我們?cè)谡n堂教學(xué)中強(qiáng)調(diào)分析過(guò)程包括取樣、試樣的處理與分解、分離與富集、分析方法的選擇與分析測(cè)定、分析結(jié)果的計(jì)算與評(píng)價(jià)，共5步。但在實(shí)驗(yàn)中，學(xué)生對(duì)此體會(huì)并不深刻。此外，傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)以開設(shè)驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)和簡(jiǎn)單實(shí)驗(yàn)為主，設(shè)計(jì)性內(nèi)容較少，涉及到的現(xiàn)代新技術(shù)、新應(yīng)用的內(nèi)容也比較少，這不利于調(diào)動(dòng)學(xué)生學(xué)習(xí)的積極性和主動(dòng)性，也不利于培養(yǎng)學(xué)生的綜合能力。

綜合實(shí)驗(yàn)是在學(xué)生完成基礎(chǔ)課程學(xué)習(xí)的基礎(chǔ)上開設(shè)的一門實(shí)驗(yàn)課程，在內(nèi)容上不局限于一門課程的內(nèi)容，可以包含在大學(xué)前幾年中學(xué)習(xí)的所有內(nèi)容，同時(shí)實(shí)驗(yàn)課時(shí)也比基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)課時(shí)長(zhǎng)，能為學(xué)生提供一個(gè)應(yīng)用所學(xué)知識(shí)解決問題的體驗(yàn)過(guò)程，并在此過(guò)程中培養(yǎng)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，提高他們解決問題的能力。下面結(jié)合教師的科研工作介紹一個(gè)適合化學(xué)專業(yè)三、四年級(jí)學(xué)生的綜合型實(shí)驗(yàn)。

1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/h2>

(1) 讓學(xué)生從問題出發(fā)，完成從取樣、樣品制備、分析條件優(yōu)化到樣品測(cè)定及數(shù)據(jù)處理的分析全過(guò)程，培養(yǎng)學(xué)生綜合分析問題和解決問題的能力。

(2) 了解分析化學(xué)的新內(nèi)容及進(jìn)展，學(xué)習(xí)固相萃取技術(shù)。

(3) 了解以士的寧為模板的分子印跡整體聚合物的原位制備方法。

2 實(shí)驗(yàn)原理

分子印跡技術(shù)(molecular imprinting technique, MIT)是指為獲得在空間結(jié)構(gòu)和結(jié)合位點(diǎn)上與某一特定目標(biāo)分子(也稱模板分子或印跡分子)完全匹配的聚合物的制備技術(shù)，具有構(gòu)效預(yù)定性、識(shí)別專一性和廣泛實(shí)用性3大特性[1]。其基本原理如圖1所示。模板分子先與功能單體相互結(jié)合形成超分子復(fù)合物，然后在交聯(lián)劑作用下，形成三維交聯(lián)高分子聚合物；當(dāng)在一定洗脫條件下除去模板分子后，即可得到具有識(shí)別空腔的分子印跡聚合物(molecularly imprinted polymers,MIPs)。這種聚合物與含有模板分子的待測(cè)溶液接觸時(shí)，能對(duì)模板分子顯示出高選擇性的結(jié)合能力，即分子識(shí)別能力[2]。MIPs具有特異選擇性、識(shí)別專一性和廣泛實(shí)用性，同時(shí)又具有物理化學(xué)穩(wěn)定性和機(jī)械強(qiáng)度好、保存方便、使用壽命長(zhǎng)和制備簡(jiǎn)單等特點(diǎn)[3]。因此，MIPs在色譜分離、固相萃取、臨床藥物分析、膜分離、模擬酶催化和仿生傳感器等領(lǐng)域的應(yīng)用日益廣泛，尤其在樣品前處理領(lǐng)域顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

圖1 分子印跡聚合物的制備原理

3 實(shí)驗(yàn)儀器及藥品

3.1 藥品

士的寧標(biāo)準(zhǔn)品，馬錢子堿標(biāo)準(zhǔn)品；α-甲基丙烯酸(MAA)，使用前減壓蒸餾；乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)，使用前用10%氫氧化鈉溶液萃取3次，再用去離子水洗滌3次，最后用無(wú)水硫酸鎂干燥；偶氮二異丁腈(AIBN)，使用前用乙醇重結(jié)晶；三甲氧基丙烯基硅烷；十二醇，甲醇，乙腈，磷酸二氫鉀，乙酸，鹽酸，磷酸，氯仿，三乙胺，氫氧化鈉，甲苯，無(wú)水硫酸鈉，以上試劑均為分析純。

市售的萬(wàn)通筋骨片、風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎片、胃爾康片和腰痛寧膠囊等藥品。

3.2 儀器

HSS-1(B)型恒溫浴槽(成都儀器廠)；PHS-3C型PH計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；KQ2200DA型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；BS124S電子天平(常州萬(wàn)泰天平儀器有限公司)；日本島津20A液相色譜系統(tǒng)：包括兩臺(tái)LC-20AT、一臺(tái)SPD-20A和六通進(jìn)樣閥，工作站：N2000；Eclipse XDB-C18柱。

4 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

4.1 分析條件的建立及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

色譜條件為：色譜柱，Eclipse XDB-C18柱；流動(dòng)相：甲醇-乙腈-KH2PO4(10mmol/L)-三乙胺(用H3PO4調(diào)pH至2.50)(體積比為5:10:85:0.5)等度洗脫，流速0.5mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，進(jìn)樣體積為20μL；柱溫30℃。在此色譜條件下，分別取質(zhì)量濃度0.010、0.025、0.050、0.10、0.25、0.50和0.75g·L-1的士的寧標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，記錄色譜圖；以標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積對(duì)濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，并計(jì)算工作曲線的線性范圍及線性相關(guān)系數(shù)。每個(gè)濃度樣品重復(fù)測(cè)定3次，并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

4.2 分子印跡整體聚合物的制備

4.2.1 玻璃管的預(yù)處理

先用水洗干凈玻璃管(d=0.5cm，L=5.0cm，尺寸可以根據(jù)實(shí)際情況調(diào)節(jié)，也可用玻璃滴管)，再用1mol·L-1氫氧化鈉溶液浸泡2小時(shí)，取出水洗后，用2.0mol·L-1鹽酸溶液浸泡2小時(shí)，取出用去離子水洗至中性，放入烘箱烘2～3小時(shí)后取出備用[4]。向處理好的玻璃管中加入通氮?dú)獬醯?%硅烷化試劑的甲苯溶液，密封兩端，在90℃下靜置2小時(shí)。

4.2.2 士的寧分子印跡聚合物的合成

將25.5mg模板分子士的寧、0.025mL單體甲基丙烯酸、0.22mL交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯、致孔劑(0.07mL甲苯、0.39mL十二醇)依次加入容器中，超聲處理使其成為均一體系，加入2.4mg引發(fā)劑偶氮二異丁腈超聲處理至完全溶解，通氮?dú)?分鐘，然后將上述溶液加入硅烷化處理過(guò)的玻璃管中，用硅膠頭密封兩端，在50℃恒溫水浴條件下聚合[5]。反應(yīng)12小時(shí)后，打開兩端的密封頭，采用如圖2的裝置，用甲醇-乙酸(體積比為4:1)溶液沖洗玻璃管柱，直至洗脫液中檢測(cè)不出模板分子士的寧(用紫外-可見分光光度計(jì)或液相色譜對(duì)洗脫液進(jìn)行檢測(cè))。

制作空白柱時(shí)，除不加模板分子外，均按照上述方法制備。

圖2 洗滌模板裝置

4.3 洗脫條件的優(yōu)化

4.3.1 甲醇比例

準(zhǔn)確吸取0.50mL質(zhì)量濃度為1.0g·L-1的士的寧水溶液，加到制備的萃取柱中，用甲醇比例(體積分?jǐn)?shù))分別為30%、40%、50%、60%、70%的水溶液0.50mL作清洗液和洗脫液(清洗總體積均為2.0mL)，收集洗脫液，空氣流吹干，定容到0.10mL，取20μL用液相色譜測(cè)定其含量，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積比例計(jì)算回收率。以回收率最低的甲醇比例作為清洗液中的甲醇比例；以回收率最高的甲醇比例作為洗脫液的甲醇比例。

4.3.2 pH

同4.3.1，以pH分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的磷酸緩沖液和甲醇混合液(體積分?jǐn)?shù)為50%)為洗脫液測(cè)定回收率，以回收率最低的pH作為清洗液的酸度；以回收率最高的pH作為洗脫液的酸度。

4.4 回收率測(cè)定

分別取0.050、0.10和0.15mL質(zhì)量濃度為1.0g·L-1的士的寧水溶液，加到制備的萃取柱中，用4.3確定最佳條件的清洗液洗4次，每次0.50mL，再用4.3確定最佳條件的洗脫液洗脫4次，收集洗脫液，空氣流吹干，定容到0.10mL，取20μL，用液相色譜測(cè)定含量，每個(gè)濃度的樣品測(cè)定3次，計(jì)算回收率及標(biāo)準(zhǔn)偏差。非印跡柱的回收率同法測(cè)定。

4.5 識(shí)別能力考查

選取與士的寧結(jié)構(gòu)相似的馬錢子堿作為競(jìng)爭(zhēng)分子，同4.3的方法，測(cè)定馬錢子堿在固相萃取小柱上的回收率，通過(guò)比較馬錢子堿和士的寧的回收率考察得到的固相萃取小柱的專屬性。

4.6 樣品制備

選取含士的寧的中藥(如萬(wàn)通筋骨片、風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎片、胃爾康片和腰痛寧膠囊等)去除糖衣后研細(xì)，準(zhǔn)確稱取1.0000g，置于帶塞的錐形瓶中，加3.0mL氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)pH=9.0，放置30分鐘；然后加20mL氯仿，分3次萃取，收集萃取液，用鋪有無(wú)水硫酸鈉的濾紙過(guò)濾，置水浴中蒸干氯仿。加2.0mL甲醇溶解，得萃取溶液[6]。

4.7 樣品測(cè)定

準(zhǔn)確吸取0.50mL萃取液，注入制備的萃取柱中，同4.4的方法測(cè)定，記錄色譜圖并計(jì)算樣品中的士的寧含量。圖3為實(shí)際樣品的色譜分離圖，圖中約8分鐘處的峰為士的寧的色譜峰。對(duì)比圖3中的線段2和3，可以清楚地看到士的寧分子印跡固相萃取柱可以有效地純化和富集樣品中的士的寧。

圖3 實(shí)際樣品的色譜分離圖1 標(biāo)準(zhǔn)士的寧溶液；2 經(jīng)過(guò)固相萃取柱后的樣品；3 未經(jīng)處理的樣品

色譜柱：Eclipse XDB-C18柱；流動(dòng)相：甲醇-乙腈-KH2PO4(10mmol/L)-三乙胺(pH2.5，體積比5:10:85:0.5)等度洗脫，流速0.5mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，柱溫30℃

5 數(shù)據(jù)處理

(1) 在建立的色譜條件下繪制士的寧的工作曲線，包括線性范圍、線性相關(guān)系數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)偏差。

(2) 分別計(jì)算士的寧和馬錢子堿在印跡柱和非印跡柱上的回收率。

(3) 計(jì)算樣品中的士的寧含量。

6 實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

(1) 對(duì)玻璃管進(jìn)行預(yù)處理是為了防止整體柱柱床與玻璃管內(nèi)壁間產(chǎn)生裂縫。由于硅烷化試劑易與水和醇反應(yīng)而失效，所以應(yīng)干燥保存；在處理玻璃管時(shí)，一定要保證玻璃管內(nèi)壁干燥。

(2) 在合成聚合物時(shí)，如果室溫較高(超過(guò)25℃)，加入引發(fā)劑偶氮二異丁腈后，在進(jìn)行超聲處理和通氮?dú)鈺r(shí)，最好將反應(yīng)混和液放在冰浴中，以防止在容器中發(fā)生聚合反應(yīng)。

7 總結(jié)

分子印跡整體萃取柱的制備及其應(yīng)用作為化學(xué)相關(guān)專業(yè)學(xué)生的綜合實(shí)驗(yàn)，能使學(xué)生從解決生活中的實(shí)際問題出發(fā)，通過(guò)取樣、樣品制備、分析條件優(yōu)化、樣品測(cè)定及數(shù)據(jù)處理等步驟，體驗(yàn)從提出問題到解決問題的全過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)?zāi)芤l(fā)學(xué)生進(jìn)行思考，使他們更全面地理解和運(yùn)用課堂知識(shí)，有利于培養(yǎng)學(xué)生分析問題和解決問題的能力；同時(shí)，實(shí)驗(yàn)中使用的樣品直接來(lái)自生活，在實(shí)驗(yàn)內(nèi)容中融合了樣品前處理領(lǐng)域的新技術(shù)和新方法，可以有效地激發(fā)學(xué)生的科研積極性和學(xué)習(xí)興趣。

[1] Jafari M T,Rezaei B,Zaker B.AnalChem,2009,81(9):3585

[2] Haupt K,Mosbach K.ChemRev,2000,100(7):2495

[3] Haupt K.ChemCommun,2003(2):171

[4] 張靜,賀浪沖,傅強(qiáng).分析化學(xué),2005,33(1):113

[5] Zhang J,Yue X F,Liang P P.JLiqChromatogrRelatedTechnol,2010,33(6):770

[6] 劉剛,周健,羅毅.廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào),2003,19(3):211