亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        啤酒酵母RNA提取條件的優(yōu)化及其磁性固定化

        2012-09-25 09:06:30英,輝,楞,
        關(guān)鍵詞:啤酒酵母微球磁性

        王 紅 英, 孫 井 輝, 錢 斯 日 古 楞, 李 長 青

        ( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

        0 引 言

        RNA是生物體最重要的基因表的物質(zhì)基礎(chǔ),除了在生物體正常的生長外,它與生命的異常如腫瘤等有密切關(guān)系。雙鏈RNA對基因表達的阻斷被稱為RNA干預(yù)(RNA interference,RNAi)[1]。雙鏈RNA經(jīng)酶切后會形成很多小片段,稱為siRNA。它與mRNA中的同源序列互補結(jié)合,會導(dǎo)致其對應(yīng)的mRNA失去功能,使基因“沉默”,以此治療疾病[2-3]。但siRNA進入細胞后易被降解,故穩(wěn)定和快速傳遞siRNA的新型給藥系統(tǒng)的研究較為關(guān)注[4]。以磁性微球為載體的靶向藥物能夠使藥物靶向傳遞,減輕藥物對其他部位的不良反應(yīng),同時通過磁場富集的藥物能夠提高療效。因此磁性固定化能夠使siRNA快速到達目的部位和避免運輸過程中的降解。

        本研究對啤酒酵母總RNA進行提取,并對其進行磁性固定化研究,以期為磁性固定化siRNA的靶向性研究和RNAi研究提供參考。

        1 材料與方法

        1.1 材 料

        啤酒酵母(S.cerevisiae);磁性殼聚糖微球,本實驗室自制[5];戊二醛,天津基準化學(xué)試劑有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

        1.2 方 法

        1.2.1 酵母RNA的提取

        采用濃鹽法提取酵母RNA[6]。將8 g酵母加入質(zhì)量分數(shù)為10%的NaCl溶液中,置于100 ℃ 水浴鍋中攪拌4 h,冷卻后在3 500 r/min條件下離心10 min。將上清液用6 mol/L鹽酸調(diào)pH至2.4,在冰浴中靜置使其完全沉淀,將所得上清液以3 500 r/min離心10 min獲得核酸沉淀物。用體積分數(shù)95%乙醇洗滌沉淀物質(zhì),去除殘余雜質(zhì)及色素;沉淀再用乙醚洗滌兩次,通過布氏漏斗抽濾,冷凍干燥獲得RNA粉末。

        1.2.2 定磷法測定啤酒酵母RNA質(zhì)量分數(shù)

        磷標準曲線制作用最小二乘法作線性回歸,得回歸方程。

        Y=0.047 0X-0.002 7,R2=0.999 6

        w(RNA)=10-6n(T1/m1-T2/m)(340/31)

        式中,T1,總磷微克數(shù);T2,無機磷微克數(shù);n,稀釋倍數(shù);m1,樣品數(shù),μg;m,樣品質(zhì)量,μg;340,RNA平均相對分子質(zhì)量;31,磷的原子數(shù)。

        1.2.3 磁性微球固定化RNA

        準確稱取10 mg磁性殼聚糖微球,用3%的戊二醛溶液浸泡2 h,對其進行活化。再用無水乙醇和超純水對微球反復(fù)洗滌,洗去多余的戊二醛等。將活化好的微球加入到一定質(zhì)量分數(shù)的RNA溶液(質(zhì)量濃度為2 mg/mL),在40 ℃條件下振蕩4 h,得到磁性固定化RNA。用磁場將磁性RNA沉淀,用超純水洗滌沉淀至上清液無RNA洗出。匯集上清液,測定RNA總量。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 酵母RNA提取的正交優(yōu)化試驗

        采用正交分析方法對濃鹽法提取酵母RNA提取影響因素進行優(yōu)化,試驗設(shè)計為L9(34)正交試驗,試驗方案見表1。

        表1 酵母RNA提取的正交試驗因素與水平

        Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiment of the yeast RNA extraction

        水平At/hBθ/℃Cw(NaCl)/%Dw(酵母)/%12908823951010341001212

        由表2、3可見,因素A即反應(yīng)時間為最顯著影響因子。最佳提取工藝為A3B3C2D1,即反應(yīng)時間4 h,反應(yīng)溫度100 ℃,氯化鈉質(zhì)量分數(shù)10%,酵母質(zhì)量分數(shù)8%,最佳提取條件下RNA的提取率可達6.13%。

        表2 酵母RNA提取的正交試驗結(jié)果與分析

        Tab.2 Results and analysis of orthogonal experiment of the yeast RNA extraction

        試驗號ABCD提取率/%111114.70212225.52313336.00421234.82522315.59623126.01731324.88832135.45933216.13均值15.4074.8005.3875.473均值25.4735.5205.4905.470均值35.4876.0475.4905.423極差0.0801.2470.1030.050

        表3 正交試驗方差分析表

        Tab.3 Variance analysis of orthogonal experiment

        因素偏差平方和自由度F比F臨界值顯著性抽提時間2.3502111.90519.000*抽提溫度0.02121.00019.000NaCl質(zhì)量分數(shù)0.01120.52419.000酵母質(zhì)量分數(shù)0.00520.23819.000誤差0.0202

        2.2 RNA固定化條件的優(yōu)化

        2.2.1 固定化最佳RNA添加量

        取8只100 mL三角瓶,分別加入10 mg經(jīng)活化的磁性微球,再分別加入5、10、15、20、25、30、35和40 mL RNA溶液(質(zhì)量濃度為2 mg/mL),40 ℃恒溫振蕩4 h,用磁鐵將磁性RNA沉淀,過濾、洗滌、收集上清液,通過定磷法測定總RNA質(zhì)量分數(shù),結(jié)果如圖1所示。由圖1可知,當RNA添加量不足30 mL時,固定化后的洗滌上清液中游離的RNA極少,說明少于30 mL 添加量的RNA完全被固定化;當RNA添加量超過30 mL時,上清液中的游離RNA量逐漸增大,說明微球表面固定化RNA達到飽和,繼續(xù)增加RNA添加量,RNA固定化率不變。綜合考慮,每10 mg磁性殼聚糖微球的最佳RNA添加量為30 mL。

        2.2.2 固定化最佳反應(yīng)時間

        在4只100 mL三角瓶中各加入10 mg活化的磁性微球和30 mL RNA溶液,40 ℃振蕩2、4、6、8 h。將磁性微球沉淀,過濾,用純水洗滌,收集上清液和洗滌液,用定磷法測定其RNA質(zhì)量分數(shù),結(jié)果如圖2所示。由圖2可見,固定化時間2~8 h,上清液中RNA質(zhì)量分數(shù)先下降(4 h達到最低)而后逐漸增大。這是因為當固定化時間小于4 h,有部分RNA和微球未很好地結(jié)合;當固定化的時間大于4 h,已被固定化的部分RNA脫落,因而上清液中RNA質(zhì)量分數(shù)有所增加。因此RNA的最佳固定化時間確定為4 h。

        圖1 RNA添加量對磁性固定化的影響

        Fig.1 Effect of RNA addition on the magnetic immobilization

        圖2 固定化時間對RNA固定化的影響

        2.2.3 固定化最佳反應(yīng)溫度

        取4只100 mL三角瓶,各加10 mg活化的磁性微球,加入30 mL的RNA溶液,分別在20、30、40和50 ℃進行固定化4 h。用磁場將磁性微球沉淀,過濾,收集上清液和洗滌液,用定磷法測定其RNA質(zhì)量分數(shù),結(jié)果如圖3所示。

        圖3 溫度對RNA固定化的影響

        Fig.3 Effect of temperature on RNA immobilization

        由圖3可見,隨著固定化溫度的提高,上清液中RNA質(zhì)量分數(shù)逐漸降低,40 ℃時達到最低,當溫度超過40 ℃,上清液中RNA質(zhì)量分數(shù)提高。因此固定化最佳反應(yīng)溫度確定為40 ℃。

        3 結(jié) 論

        通過對RNA提取條件的優(yōu)化,得到了濃鹽法提取啤酒酵母RNA的最佳工藝條件,并將提取的RNA進行磁性固定化,得到磁性固定化RNA的最佳條件。在提取時間為4 h、提取溫度100 ℃、氯化鈉質(zhì)量分數(shù)10%和酵母質(zhì)量分數(shù)8%的最優(yōu)條件下,RNA的提取率達到6.13%,其中RNA提取時間對提取率的影響最為顯著。RNA的最佳固定化條件為,RNA的添加量30 mL(質(zhì)量濃度為2 mg/mL),固定溫度40 ℃,固定化時間4 h。

        本實驗對siRNA新型給藥系統(tǒng)的發(fā)明進行探索,為RNAi技術(shù)的應(yīng)用開拓一個新的道路。

        [1] DEVINCENZO J, CEHELSKY J E, ALVAREZ R, et al. Evaluation of the safety, tolerability and pharmacokinetics of ALN-RSV01, a novel RNAi antiviral therapeutic directed against respiratory syncytial virus (RSV)[J]. Antiviral Research, 2008, 77(3):225-231.

        [2] DENKBAS E B, KILICAY E, BIRLIKSEVEN C, et al. Magnetic chitosan microspheres: preparation and characterization[J]. Reactive and Functional Polymers, 2002, 50(3):225-232.

        [3] HOWARD K A, RAHBEK U L, LIU Xiu-dong. RNA interference in vitro and in vivo using a chitosan/siRNA nanoparticle system[J]. Molecular Therapy, 2006, 14(4):476-484.

        [4] 倪春,張才全. siRNA分子選擇性的導(dǎo)入靶組織細胞的方法[J]. 重慶醫(yī)學(xué), 2007, 36(24):2572-2574.

        [5] 錢斯日古楞,王紅英. 磁性淀粉復(fù)合微球的制備及其性質(zhì)[J]. 大連輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報, 2003, 22(3):191-193.

        (QIAN Si-ri-gu-leng, WANG Hong-ying. Preparation of magnetic starchy composite microspheres and its characteristics[J] . Journal of Dalian Institute of Light Industry, 2003, 22(3):191-193. )

        [6] 孫榮丹,劉瑩,張洪林,等. 濃鹽法與稀堿法在啤酒廢酵母中提取RNA的研究[J]. 氨基酸和生物資源, 2006, 28(3):76-78.

        猜你喜歡
        啤酒酵母微球磁性
        懸浮聚合法制備窄尺寸分布聚甲基丙烯酸甲酯高分子微球
        正交法探究幾種因素對啤酒酵母發(fā)酵PYF現(xiàn)象的影響
        現(xiàn)代釀酒酵母品系源自歐洲葡萄酒和亞洲黃酒品系混合體
        添加普魯蘭酶對啤酒酵母生長的影響
        生物化工(2018年1期)2018-03-01 11:58:14
        自制磁性螺絲刀
        磁性離子交換樹脂的制備及其對Cr3+的吸附
        TiO2/PPy復(fù)合導(dǎo)電微球的制備
        干拌料方式添加液態(tài)酵益的菌群活性變化
        可吸收止血微球在肝臟部分切除術(shù)中的應(yīng)用
        一種新型磁性指紋刷的構(gòu)思
        亚洲精品久久久久成人2007| 一区二区亚洲 av免费| 久久精品国产亚洲av沈先生| 国产精品激情自拍视频| 国产精品美女久久久久久| 国产啪精品视频网站丝袜| 少妇高潮紧爽免费观看| 亚洲一区二区三区偷拍视频| 国产精品无码久久综合网| 午夜无码片在线观看影院| 亚洲国产成人无码电影| 中文字幕高清视频婷婷| 天堂中文а√在线| a亚洲va欧美va国产综合| 92精品国产自产在线观看48页| 丰满巨臀人妻中文字幕| 台湾佬中文网站| 日韩精品一区二区亚洲av| 国产欧美亚洲另类第一页| 久久综合激情的五月天| 亚洲av无码专区亚洲av网站| 国产成人精品无码播放| 国产 无码 日韩| 在线观看国产激情视频| 黑森林福利视频导航| 欧美一级色图| 精品国产车一区二区三区| 蜜芽亚洲av无码精品色午夜| 亚洲综合无码无在线观看| 亚洲激情人体艺术视频| 免费人妻精品一区二区三区| 一本色道久久综合狠狠躁篇| 亚洲精品无码久久毛片| 91国产超碰在线观看| 激情亚洲一区国产精品| 亚洲性爱视频| 国产精品久久婷婷婷婷| 深夜福利国产精品中文字幕| 人妻少妇无码精品视频区| 久久伊人影院| 久久综合加勒比东京热|