張 曦, 寇 自 農(nóng), 石 羽 佳, 朱 靖 博,3

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院, 遼寧 大連 116034; 2.大連工業(yè)大學(xué) 分析測(cè)試中心, 遼寧 大連 116034; 3.大連工業(yè)大學(xué) 植物資源化學(xué)與應(yīng)用研究所, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

蛋白質(zhì)與其他物質(zhì)發(fā)生相互作用時(shí),蛋白質(zhì)的熒光強(qiáng)度也會(huì)發(fā)生改變,這一變化是表征二者相互作用非常有效的方法?，F(xiàn)有利用熒光光譜法研究小分子藥物如秋水仙堿、Indo-1、蘆丁等[1-3]與血清白蛋白相互作用的報(bào)道,然而未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道研究丹酚酸A與血清白蛋白之間的相互作用。作為載體蛋白,其在血漿中含量豐富,能和許多內(nèi)源小分子以及外源性物質(zhì)廣泛結(jié)合,在配體的傳輸和存儲(chǔ)過(guò)程中起著十分重要的作用。因此研究丹酚酸A與血清白蛋白相互作用的信息對(duì)深入研究丹酚酸A的作用機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)在生理pH條件下研究丹酚酸A與牛血清白蛋白之間的相互作用,根據(jù)熒光猝滅光譜計(jì)算兩者的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù),并判斷它們之間的主要作用力類型。

1 材料與方法

1.1 試 劑

BSA用pH=7.4的Tris-HC1緩沖溶液配制成5×10-5mol/L的母液,4 ℃低溫保存?zhèn)溆茫坏し铀酇標(biāo)準(zhǔn)品,現(xiàn)用現(xiàn)配,工作液配制為梯度濃度；實(shí)驗(yàn)用水為超純水,其他試劑均為分析純。

1.2 方 法

10 mL比色管中,依次加入0.5 mL 5×10-5mol/L 的BSA溶液和1.0 mL一定濃度的丹酚酸A溶液,超純水定容至4 mL,混合均勻。在熒光光譜實(shí)驗(yàn)中,移取一定量該混合溶液于石英熒光池中。以280 nm為激發(fā)波長(zhǎng),設(shè)置激發(fā)狹縫寬度為7.0 nm,發(fā)射狹縫寬度為7.0 nm,掃描速率為600 nm/min,分別在25、30、35 ℃下測(cè)定288～488 nm的熒光發(fā)射光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 丹酚酸A對(duì)BSA熒光光譜的影響

BSA分子包含色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸3種氨基酸殘基,能夠產(chǎn)生不同的熒光光譜,其熒光發(fā)射峰(λmax)分別位于348、303和282 nm。設(shè)定波長(zhǎng)在280 nm時(shí),BSA熒光發(fā)射峰位于340 nm附近。當(dāng)BSA溶液濃度一定時(shí),向其中加入不同濃度的丹酚酸A。結(jié)果如圖1所示。

1～7,丹酚酸A濃度分別為2.27×10-6、4.53×10-6、9.06×10-6、1.36×10-5、1.81×10-5、2.27×10-5mol/L；BSA濃度為6.25×10-6mol/L

圖1 不同濃度丹酚酸A與BSA作用的熒光發(fā)射光譜

Fig.1 The fluorescence emission spectrum of interaction between Sal A and BSA

隨著丹酚酸A濃度的增加,BSA內(nèi)源熒光強(qiáng)度規(guī)律性地降低,最大發(fā)射峰波長(zhǎng)及峰形變化不大,這說(shuō)明丹酚酸A對(duì)BSA有猝滅作用。

2.2 丹酚酸A對(duì)BSA的熒光猝滅機(jī)理

靜態(tài)猝滅和動(dòng)態(tài)猝滅是熒光淬滅的兩種基本類型[4]。假設(shè)丹酚酸A對(duì)BSA的猝滅屬于分子碰撞引起的動(dòng)態(tài)猝滅,應(yīng)符合Stern-Volmer方程[5]

F0/F=1+kqτ0[Q]=1+KSV[Q]

(1)

式(1)中,F0為未加猝滅劑時(shí)BSA的熒光強(qiáng)度；F為加入猝滅劑后BSA的熒光強(qiáng)度；[Q]為猝滅劑丹酚酸A的濃度；τ0為無(wú)猝滅劑時(shí)BSA作為熒光分子的平均壽命,對(duì)BSA來(lái)說(shuō),其τ0約為6.2 ns[6]；kq為熒光猝滅的速率常數(shù)；KSV為Stern-Volmer方程的猝滅常數(shù),

ΚSV=kqτ0

(2)

若丹酚酸A對(duì)BSA的猝滅過(guò)程為靜態(tài)猝滅,則應(yīng)符合Lineweaver-Burk方程[5]

(3)

式(3)中,K為丹酚酸A與BSA的結(jié)合常數(shù)。不同溫度下丹酚酸A對(duì)BSA熒光猝滅光譜,可由Stern-Volmer方程得到,結(jié)果如圖2所示。由圖2可看出,分別在25、30、35 ℃時(shí)F0/F-[Q]線性較差,溫度對(duì)圖線影響較小。根據(jù)不同溫度下蛋白質(zhì)熒光猝滅光譜,得到(F0-F)-1-[Q]-1的雙倒數(shù)Lineweaver-Burk圖,結(jié)果如圖3所示。由圖3則可看出,分別在25、30、35 ℃時(shí)(F0-F)-1-[Q]-1線性關(guān)系良好,不同溫度下圖線斜率變化顯著。

圖2 丹酚酸A對(duì)BSA的Stern-Volmer圖

圖3 丹酚酸A對(duì)BSA的Lineweaver-Burk圖

由圖2、3及公式(1)～(3)得出不同溫度下丹酚酸A與BSA相互作用參數(shù)KSV、kq和K(見(jiàn)表1)。

表1 丹酚酸A與BSA不同溫度下相互作用常數(shù)

Tab.1 Interaction constants of Sal A and BSA at different temperatures

θ/℃KSV/(L·mol-1)kq/(L·mol-1·s-1)K/(L·mol-1)r21r22251.78×1052.87×10141.49×1050.999 30.986 2301.86×1053.00×10141.19×1050.995 60.979 5351.63×1052.63×10148.24×1040.992 20.993 1注:r1、r2分別為L(zhǎng)ineweaver-Burk和Stern-Volmer方程的相關(guān)系數(shù)。

由表1可以看出,提高環(huán)境溫度并未表現(xiàn)出對(duì)Stern-Volmer直線斜率有所影響。而在動(dòng)態(tài)猝滅過(guò)程中,各類猝滅劑對(duì)生物大分子的最大擴(kuò)散碰撞猝滅速率常數(shù)為2.0×1010L/(mol·s)[2]。顯然,丹酚酸A對(duì)BSA的熒光猝滅速率遠(yuǎn)大于最大擴(kuò)散碰撞猝滅速率常數(shù)。而提高環(huán)境溫度使Lineweaver-Burk直線斜率增大,這是由于提高環(huán)境溫度使丹酚酸A與BSA復(fù)合物的穩(wěn)定性有所下降。由以上判斷,丹酚酸A對(duì)BSA的相互作用由于形成了復(fù)合物而引起了BSA的內(nèi)源熒光的熒光猝滅,屬于靜態(tài)猝滅范疇。

2.3 熱力學(xué)性質(zhì)

根據(jù)藥物與蛋白質(zhì)作用前后焓變?chǔ)和熵變?chǔ)判斷二者間的主要作用力。由方程式(4)、(5)可分別計(jì)算出ΔH、ΔG和ΔS。在實(shí)驗(yàn)溫度變化范圍內(nèi),ΔH隨溫度的改變忽略不計(jì)。

ln(K2/K2)=ΔH(1/T1-1/T2)/R

(4)

ΔG=ΔH-TΔS=-RTlnK

(5)

由公式(4)、(5)可求得丹酚酸A與BSA結(jié)合的熱力學(xué)參數(shù),結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 丹酚酸A與BSA相互作用的熱力學(xué)參數(shù)

Tab.2 Thermodynamic parameters of interaction of Sal A and BSA

T/KΔH/(kJ·mol-1)ΔS/(J·mol-1·K-1)ΔG/(kJ·mol-1)298-56.55-90.74-29.51303-56.55-89.47-29.44308-56.55-89.51-28.98

當(dāng)ΔS>0,ΔH>0為典型的疏水作用力；ΔH<0,ΔS<0為氫鍵和范德華力；當(dāng)ΔH<0,ΔS>0時(shí),主要存在靜電相互作用。由表2可見(jiàn),ΔG<0,表明丹酚酸A與BSA的作用是一自發(fā)過(guò)程,ΔH<0,ΔS<0,表明丹酚酸A與BSA之間的作用力主要是氫鍵和范德華作用力。

2.4 丹酚酸A與BSA的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

由于丹酚酸A與BSA之間屬于生成復(fù)合物的靜態(tài)猝滅,假設(shè)BSA有n個(gè)相同且獨(dú)立的結(jié)合位點(diǎn)可與丹酚酸A結(jié)合。如nQ+M→QnM。式中M為BSA分子；Q為丹酚酸A分子；QnM為復(fù)合物,生成常數(shù)為K。若BSA總濃度[M0]=[QnM]+[M]([M]為游離BSA濃度), 則有[QnM]=[M0]-[M]。

lg[(F0-F)/F]=lgK+nlg[Q]

(6)

通過(guò)其斜率和截距計(jì)算得丹酚酸A與BSA的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n為1.158。

3 結(jié) 論

丹酚酸A與BSA的相互作用使BSA內(nèi)源熒光規(guī)律性猝滅,猝滅機(jī)理為靜態(tài)猝滅,形成了復(fù)合物,結(jié)合常數(shù)較大,丹酚酸A與BSA之間主要由氫鍵和范德華作用力維系。25、30、35 ℃時(shí)丹酚酸A與BSA反應(yīng)的結(jié)合常數(shù)分別為1.49×105、1.19×105、8.24×104L/mol,焓變?chǔ)=-56.55 kJ/mol。結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為1.158,說(shuō)明BSA可以攜帶丹酚酸A在體內(nèi)進(jìn)行運(yùn)輸、代謝和分配。對(duì)丹酚酸A與BSA相互作用以其他監(jiān)測(cè)手段的新方法有待于進(jìn)一步深入研究。

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