孟永亮 孫彥 羅小玲

研究發(fā)現(xiàn)，蒽醌類藥物對許多實體腫瘤顯示出良好的療效[1-3]。但此類藥物由于誘發(fā)腫瘤耐藥的特性及對細胞的毒副作用使其臨床上的應用受到限制[4]。其中，阿霉素仍然是研究蒽醌類抗腫瘤藥物作用機理及觀察蒽醌類藥物臨床療效的代表性藥物，它可抑制RNA 和DNA的合成，對RNA的抑制作用最強，抗瘤譜較廣[5,7-8]，有研究表明，阿霉素作為蒽醌類藥物的代表，它可誘導含端粒重復序列的核苷酸形成分子內(nèi)G4結(jié)構(gòu)，抑制端粒的延伸反應，還可保護端粒重復序列中鳥嘌呤免遭甲基化[5-6]。

1 材料和方法

1.1 材料 大腸癌SW480細胞系購自上海細胞庫；鹽酸阿霉素（上海佳倫生物科技有限公司，批號922008）；端粒酶活性檢測試劑盒（德國Roche公司）；MTT（AMRESCO）；L15培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；新生小牛血清（杭州四季青生物工程材料公司）；二甲基亞砜（美國Sigma公司）；其它常規(guī)試劑和儀器（廣西醫(yī)科大學腫瘤學國家重點實驗室，山東萬杰醫(yī)學院生物工程省級重點實驗室）。

1.2 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱（Heal Force）；熒光顯微鏡（奧林巴斯）；倒置顯微鏡（奧林巴斯）；PCR擴增儀（bio-rad）全自動酶標儀（美國SHELLAB）。

1.3 細胞培養(yǎng) 飽和濕度條件下的細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)sw480細胞，傳代比例1:3。

1.4 細胞毒性測定 取對數(shù)生長期的sw480細胞制成2×104細胞懸液，取100μl接種于96孔培養(yǎng)皿內(nèi),使阿霉素濃度分別達到2.5、5.0、10、20μmol/l,培養(yǎng)24、48、72、96h后，每孔加入MTT液20ul，再培養(yǎng)4h，去上清，加入二甲基亞砜。在酶聯(lián)免疫檢測儀上，測定490nm處的光密度吸收值，計算不同濃度阿霉素對SW480細胞的增殖抑制率。實驗重復三次，計算平均值。

根據(jù)實驗結(jié)果，選擇經(jīng)阿霉素作用72小時后細胞生長抑制率在50%以下的最小作用濃度作為隨后的作用濃度，防止因阿霉素細胞毒作用過大而干擾觀測其對sw480細胞端粒酶活性的影響。

1.5 PCR-TRAT-Elisa端粒酶活性檢測試劑盒檢測大腸癌sw480細胞端粒酶活性常規(guī)方法提取經(jīng)阿霉素處理不同時間的（24，48，72，96h）的細胞，0.25%胰酶消化細胞，各取2×105個細胞移入EP管。4℃1000rpm離心10min，棄上清，加入裂解液裂解。16000轉(zhuǎn)/min離心，4℃，30分鐘，取上清，測定蛋白質(zhì)濃度，調(diào)正為5mg/ml，取待測蛋白50μg(總蛋白)，進行擴增，反應條件如下：

取5μl擴增產(chǎn)物，加入20μl變性試劑，25℃孵育10分鐘，再加入225μl雜交緩沖液，振蕩混勻后取100μl混合物加入已包被微孔板的孔中，37℃，300pm振蕩2小時，棄去雜交液，用清洗緩沖洗三次，加入抗DIG-POD工作液100μl,25℃，30分鐘，再用清洗緩沖液洗五次，加入TMB底物溶液100μl,20分鐘后再加入100μl終止液終止反應。用酶標儀測定結(jié)果A450nm、A630nm的吸光度值（A值）。

陽性結(jié)果判斷：陽性對照為sw480細胞，陰性標本經(jīng)65℃、加熱30min滅活端粒酶后作為陰性對照。陽性對照吸光度應大于1.5，陰性對照吸光度應小于0.25，待測標本⊿A＝標本吸光度A值－陰性對照吸光度A值，若標本A＞0.2，即為端粒酶陽性。

2 結(jié)果

2.1 阿霉素抑制sw480細胞增殖的量效及時效關(guān)系

MTT結(jié)果顯示，阿霉素抑制SW480細胞增殖具有濃度和時間依賴性，即藥物作用濃度越大，作用時間越長，其對細胞的抑制作用最明顯，阿霉素作用72h后，2.5μmol/L和5.0μmol/L阿霉素的生長抑制率在50%以下，而10μmol/L、20μmol/L的阿霉素生長抑制率在50%～100%之間（圖1），依據(jù)此MTT結(jié)果，本研究選擇5μmol/L作為隨后實驗的作用濃度，作用時間72h。

圖1 MTT檢測細胞增殖結(jié)果

2.2 各組細胞的端粒酶活性情況

隨處理時間延長，實驗組細胞端粒酶活性逐漸降低，72h后達到最低（P＞0.05）；見表1，圖2。

表1 加藥不同時間點各組端粒酶活性比較（±s,n=3）

表1 加藥不同時間點各組端粒酶活性比較（±s,n=3）

注：a與其他組比較

A值空白對照組 2.11±0.147加藥24h組 1.96±0.126加藥48h組 1.83±0.108加藥72h組 1.65±0.137a加藥96h組 1.62±0.145a組別

圖2 加藥不同時間點各組端粒酶活性比較

3 討論

阿霉素的細胞吸收和細胞毒性實驗已在一系列人腫瘤細胞和正常細胞系內(nèi)進行[5-6,9]，為避免嚴重細胞毒作用對細胞端粒酶活性檢測的干擾，便于觀察其生物學性狀變化，本研究首先進行了阿霉素細胞毒性實驗，依據(jù)實驗結(jié)果，確定了5μmol/L阿霉素作為本研究的實驗作用濃度。在TRAP檢測中，上述作用濃度的阿霉素對sw480細胞端粒酶介導的端粒延伸反應有明顯抑制作用。說明5μmol/L是較合適的實驗作用濃度，不會產(chǎn)生過大的細胞毒作用，在抑制細胞增殖的同時，可以對其端粒酶活性產(chǎn)生抑制作用。

本部分實驗旨在針對人大腸癌sw480細胞株單獨給予阿霉素，檢測在阿霉素單獨作用下細胞的增殖情況，檢測sw480細胞內(nèi)靶基因hTERT和端粒酶表達的變化，為以后研究綜合研究阿霉素在促進G-四鏈體形成，穩(wěn)定端粒，抑制腫瘤細胞增殖方面存在的潛力奠定研究基礎。

[1]Sui G，Soohoo C,Affar,et al.A DNA vector-based RNAi technology to suPPress gene expression in mammalian cells[J].Proc Natl Acad Sci USA,2002,99(8):5515-5520.

[2]Huang, S.T.,Wang cr,Yang Rc,et al., Wogonin, an active compound in Scutellaria baicalensis, induces apoptosis and reduces telomerase activity in the HL-60 leukemia cells[J]. Phytomedicine, 2010. 17(1): 47-54.

[3]Wei, X,Zhang Z,He M, et al. Effects of differentially expressed proteins in hepatocellular carcinoma cell treated by different telomerase inhibitors[J]. Wei Sheng Yan Jiu, 2010, 39(2): 242-245.

[4]Yamada, O., et al.Ozakik,Furukawa T,Activation of STAT5 confers imatinib resistance on leukemic cells through the transcription of TERT and MDR1[J]. Cell Signal, 2011,23(7):1119-1127.

[5]Yang, Y., Q.Y. Du, and S.Q. Wang.Synergism of an antisense oligodeoxynucleotides targeted to hTERT in combination with chemotherapeutic drugs on inhibiting the proliferation of HepG2 cells[J]. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi, 2003, 11(12): 719-721.

[6]Yang, Y. Lv QJ, Du QY, et al., Combined effects of Cantide and chemotherapeutic drugs on inhibition of tumor cells' growth in vitro and in vivo[J]. World J Gastroenterol, 2005,11(16): 2491-2496.

[7]Hillier, C.,Pe the Me, love MP, et al., Effect of adrenomedullin on the production of endothelin-1 and on its vasoconstrictor action in resistance arteries: evidence for a receptor-specific functional interaction in patients with heart failure[J]. Clin Sci (Lond), 2001,101(1): 45-51.

[8]王孝養(yǎng)，張珍祥.順鉑和依托泊苷下調(diào)非癌細胞端粒酶量及端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的表達[J].中國藥理學與毒理學雜志，2002，16（1）：41-46.

[9]Han H,Hurley LH.G-quadruplex DNA:a potential Target for Anti-Cancer Drug Design.Trends Pharm Sci,2000,21(4):136-142.