劉義德 劉志

ALI/ARDS的主要病理特征是由于肺微血管通透性增高，肺泡滲出富含蛋白質的液體導致肺水腫，進而出現嚴重低氧血癥。蛋白激酶C（PKC）已被證明在急性肺損傷中可被激活，作用于肺微血管內皮細胞的骨架蛋白，引起內皮回縮，細胞間隙增大，是引起血管通透性增加的一條重要途徑[1]。Src抑制的蛋白激酶C底物（SSeCKS）是一種新發(fā)現的細胞支架蛋白，其相對分子量是280/290kDa，它不僅是PKC的結合底物，而且還是PKC和蛋白激酶A(PKA)的錨定蛋白，是PKC/ PKA的信號傳導關鍵環(huán)節(jié)。研究發(fā)現SSeCKS是一種炎癥反應蛋白，參與炎癥所致的肺組織和血管內皮細胞的損傷，其表達與炎癥的嚴重程度相關[2]。近年來研究發(fā)現長期飲酒是ARDS發(fā)病的危險因子，其機制之一是促使炎性因子釋放，增強炎癥反應。長期飲酒是否引起肺組織SSeCKS的表達改變，目前未見報道，我們通過建立長期飲酒后內、外源性肺損傷動物模型來觀察SSeCKS在長期飲酒后肺組織的表達變化及在不同病因導致的肺損傷時是否存在表達差異，為臨床治療急性肺損傷提供新的治療思路。

1 材料和方法

1.1 實驗材料和儀器

1.1.1 動物分組及模型制備：雄性SD大鼠36只，體重210g～250g（中國醫(yī)科大學實驗動物部提供)，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（23±2）℃，日照時間為12小時光照，分6籠飼養(yǎng)，每籠6只。

1.1.2 長期飲酒模型建立：將大鼠隨機分為飲水組和飲酒組，每組18只，按照文獻建立長期飲酒模型方法[3]，先適應喂養(yǎng)3天，然后予以6%酒精替代飲水給飲酒組大鼠飲用3天，再換成10%酒精飲用4天，以后予以20%酒精連續(xù)飲用5周。飲水組自由飲水，兩組飼料均為清潔級全營養(yǎng)顆粒飼料。

1.1.3 肺內外源性肺損傷模型建立：6周后，將飲水組和飲酒組大鼠各隨機分成3組，分別是單純飲水組6只、飲水內源性肺損傷組6只、飲水外源性肺損傷組6只，單純性飲酒組6只，飲酒內源性肺損傷組6只、飲酒外源性肺損傷組6只。內源性肺損傷組大鼠經稱重后予以1%戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔注射麻醉后，經頸正中切口分離氣管，用7號針頭刺入氣管緩慢滴入脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）（15mg/kg）；外源性肺損傷大鼠予以LPS（15mg/kg）腹腔注射。

1.1.4 標本采集 給藥4小時后，1%戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔注射麻醉后，放血處死大鼠，打開胸腔將雙肺完整取出，用冰鹽水仔細漂洗，清除上面的血跡，干紗布拭干，保存于-80℃冰箱待檢。

1.1.5 實驗儀器和主要試劑 高速冷凍離心機（sigma公司），PCR擴增儀(ABI公司)，紫外分光光度計(UV-visible Spectrometer)，Triozol Reagent（Invitrogen公司），引物合成（北京華大基因公司），熒光定量PCR試劑盒（大連寶生物公司），大腸桿菌脂多糖（LPS，sigma公司）。

1.2 操作步驟

1.2.1 Trizol法抽提總RNA。參照Trizol說明書采取一步法提取總RNA。取0.1g肺組織置于1.5毫升離心管中加入Trizol 1ml，在冰浴中迅速勻漿15～30秒充分研碎組織，置于室溫中5分鐘，后加入0.2ml氯仿?lián)u振15秒，置室溫3分鐘，4℃離心，12000g×15min。吸取上清液0.5ml加入0.5ml異丙醇搖勻，-20℃置2小時，4℃離心12000g×15min。棄上清，加75%乙醇1ml，4℃離心，7500g×15min。棄上清，加Nuclease free water 15μl。采用紫外可見光分光光度計測定260nm、280nm OD值，樣品-80℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 RNA濃度和純度測定。取1μl RNA樣本，加79μl DEPC水，紫外分光光度計測OD260與OD280，二者比值應1.8～2.0，提示樣本中RNA純度合格。RNA(μg/μl)濃度＝OD260×40×稀釋倍數/1000。

1.2.3 逆轉錄合成cDNA。將2μlRNA加入到逆轉錄體系中合成cDNA，反應體系為20μl，其中PrimeScript RT Enzyme Mix I 1μl、5×PrimeScript Buffer 4μl、Random 6 mers（100μM）1μl、Oligo dT Primer（50μM）1μl。Rnase Free dH2O 11μl。反應條件為：37℃15min，85℃5s。

1.2.4 引物的設計與合成。用于PCR的大鼠SSeCKS和內參GAPDH的引物均由北京華大基因公司合成。根據GenBank提供的SSeCKS基因序列（AY695056)設計上游引物為5’-AAGTGCTGGCTTCGGAGAAAG-3’(3106 3126)，下游引物為5’-TGACTTCAGGAACTT CAAGGCTC-3’(3215 3237)，內參GAPDH 序列為上游引物5’-GCAAGTTCAACGGCACA-3’,下游引物5’-CATTTGATGTTAGCGGGAT-3’。

1.2.5 PCR擴增。 PCR按照說明在ABI PRISM7500序列檢測系統(tǒng)中進行，對cDNA樣本進行雙份檢測以減小誤差。數據按2-△△CT法計算，結果以相對于GAPDH的倍數來表示。

1.3 統(tǒng)計學方法

用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，數據用均數±標準差±s)表示，各組均數的比較行單因素方差分析，用最小顯著差法(1east significant difference，LSD)作兩兩比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

圖1 飲水和飲酒各組肺組織SSeCKSmRNA表達變化

圖2 飲水各組肺組織SSeCKSmRNA表達變化

圖3 飲酒各組肺組織SSeCKSmRNA表達變化

2 結果

單純飲酒組肺組織SSeCKSmRNA表達較飲水組增多（P＜0.05），肺損傷各組肺組織SSeCKSmRNA表達較飲水組增多（P＜0.01），飲酒內、外源性肺損傷各組較飲水內、外源性肺損傷各組增多顯著（P＜0.05），飲酒內、外源性肺損傷組之間表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖1～3。

3 討論

SSeCKS是于1995年被Lin等在NIH3T3細胞中發(fā)現一種PKC的底物，其氨基端內豆蔻酰化，輔助其與細胞質膜結合，二級結構呈桿狀，富含丙氨酸、賴氨酸、絲氨酸和谷氨酸基，是一種熱穩(wěn)定蛋白[4]。人與大鼠SSeCKS的DNA序列有高度的同源性。

在實驗中發(fā)現長期飲酒大鼠肺組織的SSeCKS表達較單純飲水大鼠有所增加。導致這一結果可能的機制為酒精的主要代謝產物乙醛可升高大鼠血清中AngⅡ的水平。當AngⅡ作用于血管平滑肌細胞后，SSeCKSmRNA水平有明顯升高，并通過細胞內信號傳導機制參與了細胞支架和細胞外基質的重構，改變了血管的通透性[5]。增加了肺損傷的易感性。

SSeCKS是一種炎癥反應蛋白，腹腔注射LPS后，可觀察到肺臟、心臟、肝臟、等組織的內皮細胞SSeCKS mRNA表達增加，其中肺組織表達最為明顯[6]，研究表明SSeCKS在肺組織中定位于肺微血管內皮細胞（PMVEC）[7]。PMVEC是炎癥反應的重要反應細胞。當受到炎癥刺激時可激活PKC，作用于骨架蛋白，引起內皮細胞的回縮，細胞間的粘附體變弱，甚至消失而間隙增大，使血管通透性增加[8]。SSeCKS作為細胞支架蛋白，既是PKC的結合蛋白又是PKC作用的底物，在細胞骨架重構、細胞分化和運動過程中起到很重要作用[9]。本實驗顯示SSeCKSmRNA在損傷各組肺組織中表達均明顯增加，同其他研究結果相一致。飲酒損傷各組增加較飲水損傷各組更加顯著。提示長期飲酒損傷組由于受到AngⅡ及LPS雙重刺激使SSeCKS表達進一步增加。外源性肺損傷組SSeCKSmRA表達有高于內源性肺損傷組趨勢，但無統(tǒng)計學意義。由于SSeCKS定位于肺微血管內皮細胞，因此，外源性肺損傷時其表達更為明顯。同時SSeCKS當受到LPS誘導時表達具有時間依賴性[10]，所以本實驗內、外源組表達未見統(tǒng)計學差異，考慮可能與所選取的時間點有關，需進一步深入研究。

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[6]Kitamura H, Okita K, Fujikura D, et al. Induction of Srcsuppressed C kinase substrate (SSeCKS) in vascular endothelial cells by bacterial lipopolysaccharide[J]. J Histochem Cytochem, 2002, 50:245-255.

[7]Chun Cheng, Haiou Liu, Haiyan Ge, et al. Lipopolysaccharide induces expression of SSeCKS in rat lung microvascular endothelial cell[J]. Mol Cell Biochem, 2007, 305: 1-8.

[8]Tinsley JH, Breslin JW, Teasdale NR, et al. PKC-dependent,burn-induced adherens junction reorgnization and barrier dysfunction in pulmonary microvascular endothelial cells[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physio1, 2005, 289: L217-L223.

[9]Rung-ruangkijkrai T, Fujikura D, Kitamura H, et al. The expression of src-suppressed C kinase substrate (SSeCKS) and uptake of exogenous particles in endothelial and reticular cells[J]. Arch Histol cytol,2004,67:135-147.

[10]李惠,孫耕耘,費黎明,等.脂多糖誘導肺微血管內皮細胞SSeCKS mRNA表達的研究[J].中國危重病急救醫(yī)學,2008,2:65-68.