潘發(fā)福 梁明春 劉卉芳 呂 誠(chéng) 胡小令 萬(wàn) 斌 楊寶林 聶 菁

(南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，江西 南昌 330006)

慢性腦缺血(CCI)所致的免疫炎癥反應(yīng)可引起神經(jīng)元變性死亡，損害突觸可塑性，從而構(gòu)成了CCI導(dǎo)致認(rèn)知功能損害的重要病理生理基礎(chǔ)〔1〕。突觸素(SYN)是突觸前囊泡上的一種蛋白質(zhì)，參與神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，是突觸終末的特異性標(biāo)記物〔2〕。突觸后致密物95(PSD-95)是突觸后致密物中含量最豐富的骨架蛋白，在突觸后膜受體定位和信號(hào)傳導(dǎo)通路中發(fā)揮重要的作用。雷公藤提取物雷公藤多甙可以改善CCI大鼠認(rèn)知功能〔3〕。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎法(2-VO)建立CCI動(dòng)物模型，選取突觸相關(guān)的兩種蛋白(SYN、PSD-95)作為檢測(cè)指標(biāo)，進(jìn)一步探討雷公藤多甙的主要成分雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)CCI模型大鼠突觸可塑性的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 雷公藤內(nèi)酯醇(純度為99.8%，批號(hào)070929，福建省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所，溶于4%丙二醇溶液中);SP試劑盒(Zymed公司);DAB顯色試劑盒(北京中杉公司);SYN、PSD-95兔抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司);PCR擴(kuò)增用引物(上海生物工程有限公司);2×EasyTaq PCR SuperMix(北京全式金生物技術(shù)有限公司);RevertAidTM HMinus First Strand cDNA Synthesis Kit(Formentas公司);快速恒溫冰凍切片機(jī)YD-1508Ⅲ(浙江金華益迪醫(yī)療設(shè)備廠);Image.Pro Plus v5.1顯微圖像分析系統(tǒng)(Media Cybernetics公司);MG25+基因擴(kuò)增儀(杭州朗基科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組和模型建立 取30只4月齡、體重250～275 g的健康雄性SD大鼠(南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供)，隨機(jī)分成:對(duì)照組、模型組、治療組。模型組和治療組大鼠采用2-VO建立CCI模型:腹腔注射1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)，常規(guī)碘附消毒，取頸部正中切口，分離出頸總動(dòng)脈，永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈，確認(rèn)結(jié)扎穩(wěn)妥后用無(wú)菌生理鹽水清洗傷口，檢查傷口，無(wú)明顯出血后用1號(hào)絲線逐層縫合切口。對(duì)照組大鼠暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈后1號(hào)絲線從其底部穿過(guò)但不結(jié)扎，清洗傷口后逐層縫合切口。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用藥 術(shù)后治療組大鼠每日腹腔注射雷公藤內(nèi)酯醇0.4 mg/kg，模型組和對(duì)照組大鼠每日腹腔注射等容積4%丙二醇溶液，連續(xù)注射28 d。

1.2.3 甲苯胺藍(lán)尼氏染色和免疫組織化學(xué)染色 每組各取5只大鼠，麻醉后行心臟灌注，0.9%生理鹽水沖洗后灌入4%多聚甲醛磷酸緩沖液，取腦組織，外固定后放入30%蔗糖磷酸緩沖液中，完全沉底后留取從前囟后3.3～4.3 mm間的背側(cè)海馬作連續(xù)冠狀冰凍切片，片厚20 μm，分別行甲苯胺藍(lán)尼氏染色和SYN、PSD-95免疫組織化學(xué)染色。免疫組織化學(xué)染色(SP法):3%H2O2去離子水，孵育10 min;正常山羊封閉血清室溫孵育20 min，傾去;分別滴加稀釋濃度為1∶100的SYN和1∶200的PSD-95一抗4℃過(guò)夜;PBS替代一抗作陰性對(duì)照;生物素化二抗37℃孵育30 min;辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液37℃孵育30 min;DAB顯色劑避光染色10 min;每只大鼠隨機(jī)抽取5張切片，在海馬CA1區(qū)隨機(jī)抽取5個(gè)不相重疊的視野，顯微鏡(×400)下采用Image.Pro Plus v5.1顯微圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)出SYN的陽(yáng)性產(chǎn)物數(shù)量和PSD-95的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及其各自平均光密度。

1.2.4 RT-PCR①RNA的提取 每組各取5只大鼠，麻醉后斷頭，快速取出海馬組織，TRIzol法提取總RNA;使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其在260 nm和280 nm波長(zhǎng)的光吸收值，OD260/OD280比值在1.8-2.0之間。②逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng):按試劑盒說(shuō)明合成cDNA。③PCR擴(kuò)增:β-actin上游引物:5'-GGT ATG GGT CAG AAG GAC TCC-3'，下游引物:5'-TGA TCT TCA TGG TGC TAG GAG CC-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度857 bp。SYN上游引物:5'-AAC AAA GGG CCT ATG ATG GA-3'，下游引物:5'-CCA GGT TCA GGA AGC CAA-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度232 bp。PSD-95上游引物:5'-GCC CTG TTT GAT TAC GAC AA-3'，下游引物5'-CTC ATA GCT CAG AAC CGA GT-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度250 bp。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性 4 min，94℃ 變性 30 s，58℃ 退火 45 s，72℃ 延伸1 min，30個(gè)反應(yīng)循環(huán)，結(jié)束72℃充分延伸5 min。④產(chǎn)物測(cè)定:1.2%的瓊脂糖凝膠，取RT-PCR產(chǎn)物6 μl上樣電泳，150 v，45 min。紫外線透射儀觀察并拍照。以SYN/β-actin、PSD-95/β-actin表示產(chǎn)物的相對(duì)含量。

2 結(jié)果

2.1 甲苯胺藍(lán)尼氏染色 對(duì)照組大鼠海馬CA1區(qū)錐體層神經(jīng)元數(shù)目和形態(tài)未見(jiàn)明顯改變，細(xì)胞呈錐形，排列規(guī)則，界限清晰;模型組大鼠海馬CA1區(qū)錐體層神經(jīng)元數(shù)目較對(duì)照組明顯減少，細(xì)胞呈不規(guī)則形，細(xì)胞界限不清，間隙增大，胞內(nèi)尼氏體減少;治療組大鼠海馬CA1區(qū)錐體層神經(jīng)元損傷程度較模型組輕，胞內(nèi)尼氏體也較模型組增加。見(jiàn)圖1。

2.2 SYN免疫組織化學(xué)染色 對(duì)照組大鼠海馬CA1區(qū)分子層SYN陽(yáng)性產(chǎn)物呈顆粒狀分布，染色深且分布均勻;模型組大鼠海馬CA1區(qū)分子層SYN陽(yáng)性產(chǎn)物染色淺，數(shù)目少且分布不均勻，與對(duì)照組相比，模型組大鼠海馬CA1區(qū)分子層SYN陽(yáng)性產(chǎn)物數(shù)量明顯減少(P＜0.01)，平均光密度明顯降低(P＜0.01);治療組大鼠海馬CA1區(qū)分子層SYN陽(yáng)性產(chǎn)物染色較深，數(shù)目較多，與模型組相比，治療組大鼠海馬CA1區(qū)分子層SYN陽(yáng)性產(chǎn)物數(shù)量明顯增多(P＜0.01)，平均光密度明顯增強(qiáng)(P＜0.01)。見(jiàn)表1，圖2。

圖1 各組大鼠海馬CA1區(qū)錐體層神經(jīng)元(甲苯胺藍(lán)尼染色，×400)

圖2 各組大鼠海馬CA1區(qū)分子層SYN陽(yáng)性細(xì)胞(免疫組織化學(xué)染色，×400)

表1 各組大鼠海馬CA1區(qū)SYN表達(dá)(± s，n=5)

表1 各組大鼠海馬CA1區(qū)SYN表達(dá)(± s，n=5)

與對(duì)照組比較:1)P＜0.01，與模型組比較:2)P＜0.01;下表同

組別 陽(yáng)性產(chǎn)物數(shù) 平均光密度對(duì)照組232.4±15.79 0.210 9±0.009 8模型組 121.1±12.281) 0.142 8±0.014 41)治療組 190.7±19.551)2) 0.183 5±0.008 21)2)

2.3 PSD-95免疫組織化學(xué)染色 對(duì)照組大鼠海馬CA1區(qū)錐體層PSD-95陽(yáng)性細(xì)胞分布較密集，呈錐形，可見(jiàn)軸突和樹(shù)突樣突起;模型組大鼠海馬CA1區(qū)錐體層PSD-95陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和平均光密度明顯低于對(duì)照組(P＜0.01);治療組大鼠海馬CA1區(qū)錐體層PSD-95陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和平均光密度明顯高于模型組(P＜0.01)。見(jiàn)表2，圖3。

表2 各組大鼠海馬CA1區(qū)PSD-95表達(dá)(± s，n=5)

表2 各組大鼠海馬CA1區(qū)PSD-95表達(dá)(± s，n=5)

組別 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) 平均光密度對(duì)照組34.60±2.650 0.288 3±0.016 7模型組 21.74±2.6331) 0.234 4±0.018 41)治療組 30.64±3.6181)2) 0.259 5±0.016 31)2)

2.4 SYN和PSD-95mRNA的表達(dá) RT-PCR和凝膠電泳顯示，在232 bp片段大小位置可見(jiàn)SYN mRNA陽(yáng)性條帶，在250 bp片段大小位置可見(jiàn)PSD-95 mRNA陽(yáng)性條帶。模型組大鼠海馬組織SYN和PSD-95 mRNA相對(duì)含量明顯低于對(duì)照組(P＜0.01)，治療組大鼠海馬組織SYN和PSD-95 mRNA相對(duì)含量明顯高于模型組(P＜0.01)。見(jiàn)表3，圖4，圖5。

圖3 各組大鼠海馬CA1區(qū)錐體層PSD-95陽(yáng)性細(xì)胞(免疫組織化學(xué)染色，×400)

表3 各組大鼠海馬SYN和PSD-95 mRNA的表達(dá)水平(± s，n=5)

表3 各組大鼠海馬SYN和PSD-95 mRNA的表達(dá)水平(± s，n=5)

組別SYN mRNA PSD-95 mRNA對(duì)照組0.564 3±0.037 8 0.748 7±0.041 2模型組 0.257 9±0.009 91) 0.352 7±0.025 91)治療組 0.458 5±0.0251)2) 0.655 5±0.021 51)2)

圖4 各組大鼠海馬組織SYN RT-PCR結(jié)果

圖5 各組大鼠海馬組織PSD-95 RT-PCR結(jié)果

3 討論

有研究證實(shí)CCI中星形膠質(zhì)細(xì)胞增生并活化，活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞的在缺血損傷后可分泌大量的細(xì)胞因子等炎性介質(zhì)，參與CCI所致的腦損傷〔4〕。Farkas等〔5〕研究表明腦缺血后還可激活小膠質(zhì)細(xì)胞。激活的小膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)型一氧化氮合酶和環(huán)氧合酶-2的表達(dá)增加，導(dǎo)致其誘導(dǎo)產(chǎn)物一氧化氮、前列腺素E2大量合成〔6〕。激活的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分泌的免疫炎性介質(zhì)，反過(guò)來(lái)又可進(jìn)一步激活神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，從而形成正反饋環(huán)路，促成CCI腦內(nèi)慢性免疫炎癥反應(yīng)的形成和炎性產(chǎn)物的持續(xù)升高，導(dǎo)致神經(jīng)元變性、損傷和死亡〔7〕。我實(shí)驗(yàn)室同期實(shí)驗(yàn)證實(shí)了CCI后神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增殖并激活。本實(shí)驗(yàn)表明本實(shí)驗(yàn)室制作的CCI模型大鼠模擬了神經(jīng)元損傷、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生等病理改變。

SYN參與神經(jīng)遞質(zhì)釋放和突觸囊泡循環(huán)，與突觸的重建及認(rèn)知過(guò)程密切相關(guān)〔2〕。Schmitt等〔8〕研究SYN表達(dá)水平變化與學(xué)習(xí)記憶之間的關(guān)系，結(jié)果顯示海馬部神經(jīng)元缺血后變性壞死，SYN陽(yáng)性產(chǎn)物表達(dá)明顯減少，大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力均下降。王冰等〔9〕利用2-VO法建立血管性癡呆模型小鼠，發(fā)現(xiàn)海馬區(qū)PSD-95免疫陽(yáng)性產(chǎn)物減少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述文獻(xiàn)報(bào)道一致。CCI后SYN和PSD-95表達(dá)減少的原因可能有:①CCI所致的免疫炎癥反應(yīng)引起神經(jīng)元變性死亡，而后者可導(dǎo)致突觸的丟失;②CCI后受損神經(jīng)元的代謝活動(dòng)減弱和蛋白質(zhì)的合成能力下降;③CCI所致的免疫炎癥反應(yīng)直接損害突觸可塑性〔10〕。

雷公藤內(nèi)酯醇能夠減少炎癥因子的表達(dá)，具有明顯的抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用，能促進(jìn)突觸功能以及促進(jìn)髓鞘形成，還能改善記憶和認(rèn)知功能〔11〕。本實(shí)驗(yàn)提示雷公藤內(nèi)酯醇可能通過(guò)抑制CCI引起的免疫炎癥反應(yīng)，促進(jìn)大鼠海馬神經(jīng)元SYN和PSD-95的表達(dá)，對(duì)突觸的可塑性起到一定的保護(hù)作用。

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