房新輝 楊玉秀(河南省人民醫(yī)院消化內(nèi)科，河南 鄭州 450003)

肝細(xì)胞癌(HCC)是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，每年新發(fā)50萬～100萬例，我國約占半數(shù)，已成為肝癌發(fā)病最集中的地區(qū)之一。CD24是一種低分子量高度糖基化的黏附分子，具有多種功能性的糖基化模式。體外培養(yǎng)和動物模型已經(jīng)證實(shí)，CD24對多種腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移具有調(diào)節(jié)作用。目前，有關(guān)CD24在HCC發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)作用和臨床意義尚不明了。本研究擬探討CD24在HCC中的作用及其與臨床病理特征的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 河南省人民醫(yī)院70例肝臟疾病患者納入本研究，男34例，女36例，年齡34～58〔平均(46±8)〕歲。其中肝血管瘤手術(shù)切除的周圍正常肝組織20例，肝硬化手術(shù)切除肝組織20例，HCC手術(shù)切除組織30例，均經(jīng)病理檢查證實(shí)。肝硬化、HCC患者血清乙肝病毒表面抗原(HBsAg)陽性。參照Edmendsen標(biāo)準(zhǔn)，HCC病理分級為Ⅰ級7例、Ⅱ級8例、Ⅲ級10例、Ⅳ級5例。三組病例年齡及性別有可比性。標(biāo)本取出后置于液氮迅速冷凍，－80℃冰箱凍存待用。所取組織新鮮，并經(jīng)過患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 寡核苷酸基因芯片分析 按照Invitrogen公司的Trizol試劑盒操作程序，總RNA提取、cRNA合成、芯片雜交和檢測、數(shù)據(jù)分析等方法見文獻(xiàn)〔1〕。

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄PCR (1)抽提總RNA:用Trizol試劑(QIAGEN公司)分別抽提正常肝組織、肝硬化和HCC組織總RNA。(2)擴(kuò)增引物設(shè)計:內(nèi)參基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)上游引物:5'GGGAAACTGTGGCGTGAT 3'，下游引物:5'AAAGGTGGAGGAGTGGGT 3';擴(kuò)增片段長度309 bp。目的基因CD24上游引物:5'CTGCTGGCACTGCTCCTA 3，下游引物:5'AGAGTGAGACCACGAAGA 3';擴(kuò)增片段長度178 bp。(3)CD24 cDNA合成及PCR擴(kuò)增:按RT-PCR試劑盒(TaKaRa公司提供)步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)。先合成cDNA，再進(jìn)行PCR。擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。(4)擴(kuò)增產(chǎn)物圖像分析:對CD24擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行掃描和半定量分析，結(jié)果用Syngene Gene-Genius全自動凝膠成像系統(tǒng)(美國Syngene公司)檢測圖像灰度值。

1.2.3 免疫組織化學(xué) (1)主要試劑:兔抗人CD24多克隆抗體(bs-0528R)購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，SP-9001羊抗兔免疫組織化學(xué)試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑均購自北京中杉金橋生物科技有限公司。標(biāo)本經(jīng)過蘇木素-伊紅(HE)染色明確診斷并確定病理分型。(2)免疫組織化學(xué)檢測CD24:肝組織經(jīng)梯度解凍，10%多聚甲醛固定，石蠟包埋，制成4 μm厚的石蠟切片，HE染色組織學(xué)觀察。切片經(jīng)高壓熱修復(fù)，采用免疫組織化學(xué)(ABC)法，DAB顯色，HE復(fù)染，無水乙醇脫水，中性樹膠封片。以0.01 mol/L的磷酸緩沖液(PBS)(pH7.5)代替第一抗體作為陰性對照，以組織中顯示棕黃色顆粒為CD24表達(dá)陽性。(3)CD24陽性判斷標(biāo)準(zhǔn):以陽性細(xì)胞數(shù)≥10%作為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)陽性細(xì)胞百分率分為陰性(－):陽性細(xì)胞不可見或陽性細(xì)胞不足5%;弱陽性(+):陽性細(xì)胞散在或為組織細(xì)胞的1/3以下;中度陽性(?):陽性細(xì)胞呈局灶分布，占全組織細(xì)胞1/3～2/3;強(qiáng)陽性(?):陽性細(xì)胞呈彌漫分布，占全組織細(xì)胞2/3以上。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)資料以±s表示，成組設(shè)計資料采用t檢驗、χ2檢驗、Fisher精確檢驗和Kruskal-Wallis非參數(shù)檢驗。

2 結(jié)果

2.1 寡核苷酸基因芯片分析結(jié)果 以人正常肝組織和肝硬化組織為對照，CD24在HCC中呈現(xiàn)明顯上調(diào)表達(dá)(Ratio值=14.93，P＞0.5)。

2.2 RT-PCR分析結(jié)果 CD24 RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜顯示，在相當(dāng)于178 bp處有DNA片段區(qū)帶。內(nèi)參基因擴(kuò)增產(chǎn)物顯示在309 bp處有DNA片段區(qū)帶。見圖1。

HCC組織的CD24 mRNA陽性表達(dá)(27例)顯著升高，正常肝組織(5例)與肝硬化組織(13例)比較差異顯著(P＜0.01)，正常肝組織與HCC組織差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，肝硬化組織與HCC組織比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

2.3 免疫組織化學(xué)分析

2.3.1 CD24的陽性表達(dá) CD24陽性表達(dá)物呈棕黃色顆粒，彌散分布于胞質(zhì)，胞膜未見著色，不同病例的陽性胞質(zhì)著色顆粒的大小、分布密度及著色深淺亦有不同，見圖2。

正常肝組織與HCC組織CD24陽性表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義〔4例(20%)vs 28例(93.3%)，P＜0.05〕，肝硬化組織與HCC組織比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義〔14例(70%)vs 28例(93.3%)，P＞0.05〕，見表 1。

2.3.2 CD24表達(dá)強(qiáng)度與臨床病理特征的關(guān)系 CD24表達(dá)強(qiáng)度與HCC組織分化程度、Edmendsen分級之間無明顯相關(guān)性，見表2。

表1 正常肝組織、肝硬化組織和HCC組織中CD24蛋白的表達(dá)(n)

圖1 CD24 mRNA陽性表達(dá)RT-PCR產(chǎn)物電泳圖

圖2 肝硬化及HCC組織CD24陽性細(xì)胞(×200)

表2 CD24表達(dá)強(qiáng)度與HCC組織分化及核分級的關(guān)系〔n(%)〕

3 討論

HCC是癌基因或癌相關(guān)基因激活等諸多因素引起肝細(xì)胞生長失控而致〔2〕。CD24是一種低分子量高度糖基化的黏附分子，由27個氨基酸組成，通過糖基磷脂酰肌醇黏附在細(xì)胞膜上。P-選擇素是CD24的唯一配體〔3〕，通過低聚糖與CD24特異性結(jié)合。生理狀況下，CD24能夠介導(dǎo)單核細(xì)胞或中性粒細(xì)胞黏附于表達(dá)P-選擇素的活化內(nèi)皮細(xì)胞或血小板，抗P-選擇素或抗CD24抗體可阻斷這種黏附作用〔4〕。病理狀態(tài)下，CD24介導(dǎo)癌細(xì)胞與活化血小板和內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合。因此，CD24/P-選擇素的黏附途徑被推測更有利于CD24陽性腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移行為。李海飛等〔5〕研究發(fā)現(xiàn)，CD24作為分離、純化乳腺癌干細(xì)胞標(biāo)志之一，被認(rèn)為是乳腺癌預(yù)后不良因素。CD24蛋白質(zhì)在肝內(nèi)膽管癌中表達(dá)增強(qiáng)，CD24陽性患者生存期明顯縮短，多變量分析表明CD24是肝內(nèi)膽管癌的一個獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)〔6〕。Huang等〔7〕在HCC中發(fā)現(xiàn)，CD24在66%單個癌灶HCC患者中表達(dá)上調(diào)，在68%的肝內(nèi)多發(fā)瘤灶內(nèi)上調(diào)表達(dá)。CD24與腫瘤的大小、分級及患者的預(yù)后無相關(guān)。CD24的表達(dá)可能是HCC早期的分子事件，聯(lián)合甲胎蛋白(AFP)可以作為HCC早期預(yù)測指標(biāo)。CD24可能通過上述一系列復(fù)雜機(jī)制促進(jìn)HCC細(xì)胞的增殖，向周圍組織侵襲轉(zhuǎn)移，最終導(dǎo)致HCC的發(fā)生。

本研究顯示，CD24在肝硬化組織中呈現(xiàn)表達(dá)增加現(xiàn)象，在HCC組織中的表達(dá)顯著增加，推測CD24有可能作為HCC早期診斷的候選基因，也有望成為HCC的靶向分子治療途徑。

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3 王偉飛，王新穎，岳 輝，等.CD24在大腸癌組織中的表達(dá)及其對癌細(xì)胞增殖的影響〔J〕.實(shí)用癌癥雜志，2011;26(1):37-41.

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5 李海飛，魏素菊.CD24與乳腺癌及其干細(xì)胞關(guān)系的研究進(jìn)展〔J〕.實(shí)用腫瘤雜志，2011;26(2):200-3.

6 Su MC，Hsu C，Kao HL，et al.CD24 expression is a prognostic factor in intrahepatic cholangiocarcinoma〔J〕.Cancer Lett，2006;235(1):34-9.

7 Huang LR，Hsu HC.Cloning and expression of CD24 gene in human hepatocellular carcinoma:a potential early tumor marker gene correlates with p53 mutation and tumor differentiation〔J〕.Cancer Res，1995;55(20):4717-21.