譚州科，張子陽(yáng)，羅 茜，唐 智，楊亦彬

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，貴州 遵義 563099)

長(zhǎng)期使用環(huán)孢素A(CsA)導(dǎo)致的慢性環(huán)孢素腎病(CCN)是引起移植術(shù)后移植腎失功的重要原因之一，然而CsA仍是目前最重要的器官移植一線抗排斥藥物［1］，因此探討慢性環(huán)孢素腎病的發(fā)病機(jī)制并尋找有效的阻止或延緩慢性環(huán)孢素腎病的方法有重要意義。建立慢性環(huán)孢素腎病模型是進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)建立慢性環(huán)孢素腎病大鼠模型觀察其可行性，并總結(jié)該模型制作體會(huì)，為進(jìn)一步研究慢性環(huán)孢素腎病的發(fā)病機(jī)制及其防治積累有價(jià)值的模型制作資料。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 環(huán)孢素溶液50 mL:5g(由杭州中美華東制藥有限公司提供)，溶解于橄欖油，兔抗大鼠TGF－β，兔抗大鼠α－SMA一抗(美國(guó)Santa Cruz)，羊抗兔IgG(北京中杉生物技術(shù)公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及方法 雄性SD(Spragye－Dawley)大鼠，體重200～220 g，由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，清潔級(jí)(合格證號(hào)SCXK(渝)20070003)。低鹽飲食參考照 Rosen 等［2］介紹的配方委托第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心配制，測(cè)定鈉含量為0.046%(原子吸收火焰法測(cè)定)。低鹽飲食飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為4組:環(huán)孢素模型組(n=12):參照文獻(xiàn)［3］將環(huán)孢素用橄欖油稀釋成8 g/L，按 25 mg·kg－1·d－1，灌胃，每天 1 次。溶劑對(duì)照組(n=12):予橄欖油 2.5 mL·kg－1·d－1。低鹽對(duì)照組(n=12):低鹽飲食。正常對(duì)照組(n=6):正常飲食。前三組均自由攝取低鹽飲食，飲用自來(lái)水，7d稱一次體重，調(diào)整環(huán)孢素給藥量。分別于第4、6周實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)前置大鼠于代謝籠，收集24 h尿液檢測(cè)尿蛋白;靜脈采血用于血肌酐、藥物濃度測(cè)定;腎組織置于10%甲醛浸泡，用于組織學(xué)和免疫組織化學(xué)檢查。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中觀察各組大鼠體重、飲食、尿量、皮毛、活動(dòng)度等。于2、4、6周監(jiān)測(cè)環(huán)孢素血藥物濃度(給藥24 h后取靜脈血，采用熒光偏振免疫法)。

1.3 腎組織病理學(xué)檢查 將固定好的腎臟組織石蠟包埋并切片，厚度為3～4 μm。腎臟組織切片行HE、Masson染色。HE染色切片在高倍鏡(×400)下，每例隨機(jī)選擇20個(gè)不重復(fù)視野，主要觀察腎小管上皮細(xì)胞腫脹、脫落、空泡變性，以及小管萎縮等腎小管損傷;炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);小動(dòng)脈病變情況，具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參考Shihab［4］報(bào)道的方法進(jìn)行半定量評(píng)分。Masson染色觀察間質(zhì)纖維化程度:在100×鏡下盡量避開(kāi)腎小球和血管采集圖像，每例采集10個(gè)不重復(fù)視野，用HPIAS21000病理圖文分析系統(tǒng)根據(jù)病變的百分?jǐn)?shù)判定積分，將呈現(xiàn)為綠色的區(qū)域作為陽(yáng)性目標(biāo)，以陽(yáng)性面積與統(tǒng)計(jì)總面積的比值作為間質(zhì)纖維化的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參考國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)［5］:0為無(wú)病變;0.5為 ＜ 5%(每視野);1為5% ～15%;1.5為16% ～25%;2為26% ～35%;2.5為36% ～45%;3為＞45%。

1.4 腎組織TGF－β1、α－SMA免疫組化 按免疫組化SP法進(jìn)行:脫蠟、水化，3%H2O2中室溫放置.蒸餾水洗×3次.EDTA微波修復(fù)，冷卻至室溫，PBS沖洗后加入一抗(兔抗大鼠 TGF－β1/α－SMA)，4℃冰箱過(guò)夜，加入二抗(羊抗兔 IgG)，37℃孵育，PBS清洗，DAB反應(yīng)顯色，鏡下觀察并及時(shí)中止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染。實(shí)驗(yàn)中均采用PBS代替一抗作陰性對(duì)照，陽(yáng)性著染可呈棕黃色。IPWin32采圖系統(tǒng)對(duì)免疫組化染色各組切片進(jìn)行圖片采集，每張切片隨機(jī)采腎臟皮質(zhì)部五個(gè)視野;以積分光密度(IOD)為指標(biāo)對(duì)染色進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況 各對(duì)照組大鼠飲食、活動(dòng)、體重以及精神狀態(tài)良好，無(wú)大鼠死亡。而環(huán)孢素模型組大鼠飲食飲水量減少，精神萎靡，活動(dòng)差，和毛發(fā)變黃、松亂，皮膚可見(jiàn)感染、破潰、膿腫等。與對(duì)照組相比，其模型組大鼠體重明顯下降(P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)前4周模型組大鼠死亡1只(4周總死亡率約8%)，4～6周時(shí)大鼠死亡3只(6周總死亡率約30%)。死亡原因主要是感染、腹腔膿腫等?？瞻缀洼d體對(duì)照組間各時(shí)點(diǎn)無(wú)明顯差異(P＞0.05，見(jiàn)表1)。

表1 各組大鼠體重變化情況(mg，n=6)

2.2 血肌酐、尿蛋白測(cè)定 模型組大鼠4、6周時(shí)血肌酐、尿蛋白均高于同時(shí)點(diǎn)空白和載體對(duì)照組(P＜0.01，見(jiàn)表2)，空白和載體對(duì)照組間各時(shí)點(diǎn)無(wú)明顯差異(P＞0.05)。環(huán)孢素模型組4周與6周血肌酐、尿蛋白比較無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。

表2 各組大鼠血肌酐、尿蛋白情況(n=6)

2.3 環(huán)孢素血藥物濃度 實(shí)驗(yàn)過(guò)程監(jiān)測(cè)環(huán)孢素藥物濃度，第2、4、6周模型組大鼠均保持較高的環(huán)孢素血藥物濃度，分別為1584 ±126 ng/mL，1781.5 ±113 ng/mL和1435±160 ng/mL。

2.4 腎臟常規(guī)病理學(xué)檢查 空白和溶劑對(duì)照組腎小球、腎小管和間質(zhì)未見(jiàn)明顯病理學(xué)改變;環(huán)孢素模型組4、6周均可見(jiàn)明顯的小管和間質(zhì)改變，主要表現(xiàn)腎小管空泡變性、上皮細(xì)胞脫落、小管萎縮，間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，伴有小動(dòng)脈肌性增厚和玻璃樣變，間質(zhì)增寬，條帶狀間質(zhì)纖維化(6周時(shí)尤其顯著，見(jiàn)表 4、圖2)。

表3 各組大鼠腎小管損害和間質(zhì)纖維化積分(n=6)

圖1 各組大鼠腎組織病理學(xué)檢查(Masson×100)

2.5 大鼠腎臟組織TGF－β1、α－SMA免疫組化檢測(cè) 各對(duì)照組腎組織可見(jiàn)少許TGF－β1表達(dá);4、6周環(huán)孢素模型組腎組織TGF－β1表達(dá)均增強(qiáng)(P ＜0.01)，在6周時(shí)尤為明顯，表達(dá)部位主要見(jiàn)于腎小球、腎小管和腎間質(zhì)。在空白對(duì)照組和載體對(duì)照組α－SMA主要表達(dá)于血管區(qū)，在腎小管、腎間質(zhì)很少，而在4、6周環(huán)孢素模型組腎小管、間質(zhì)陽(yáng)性表達(dá)均高于同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組(P＜0.01見(jiàn)表4，圖2)。

表4 各組大鼠腎組織TGF－β1、α－SMA表達(dá)水平(IOD值，±s，n=6)

表4 各組大鼠腎組織TGF－β1、α－SMA表達(dá)水平(IOD值，±s，n=6)

注.:①組間比較:與各對(duì)照組同時(shí)點(diǎn)比較，#P＜0.01;②組內(nèi)比較:▲P＜0.01。

組 別 TGF－β1 4周 6周α－SMA 4周 6周3.93 ±0.09 4.00 ±0.09 3.87 ±0.06 3.93 ±0.04低鹽對(duì)照組 3.81 ±0.11 4.15 ±0.13 3.36 ±0.10 3.78 ±0.06溶劑對(duì)照組 3.90 ±0.09 3.98 ±0.06 3.81 ±0.05 3.95 ±0.03環(huán)孢素模型組 5.39±0.11# 5.94±0.10#▲ 5.87±0.06# 6.12±0.04#▲正常對(duì)照組

圖2 各組α－SMA免疫組化圖

3 討論

慢性環(huán)孢素腎病(CCN)是引起慢性移植腎腎病(CAN)的一個(gè)重要原因，也是影響移植術(shù)后移植物長(zhǎng)期存活的一個(gè)重要因素［6］。臨床慢性CsA腎毒性腎臟病理變化主要表現(xiàn)為:①腎小管萎縮，部分近曲小管上皮細(xì)胞空泡變性和壞死;②間質(zhì)纖維化，常呈現(xiàn)出“正常區(qū)域”伴有帶狀間質(zhì)纖維組織增生和腎小管萎縮;③可出現(xiàn)全腎小球硬化、節(jié)段性灶狀腎小球硬化等;④入球小動(dòng)脈玻璃樣變及閉塞性動(dòng)脈內(nèi)膜炎［1］。

慢性環(huán)孢素腎病模型建立是實(shí)施研究的基礎(chǔ)。目前制作慢性環(huán)孢素腎病動(dòng)物模型的方法主要有兩種［3，5，7］，低鹽飲食下或在正常飲食下配合腎上腺切除造成“鈉耗竭”，同時(shí)間斷通過(guò)皮下注射或灌胃給予環(huán)孢素兩種途徑造模。由于大鼠對(duì)環(huán)孢素毒性敏感性差，以至于常規(guī)飲食下給予環(huán)孢素可能需要半年甚至1年以上時(shí)間才能出現(xiàn)環(huán)孢素所致的慢性腎間質(zhì)纖維化，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中采用低鹽飲食或腎上腺切除，其目的主要是造成“鈉耗竭”以縮短環(huán)孢素致腎間質(zhì)纖維化的時(shí)間［5，7］。手術(shù)切除腎上腺，其死亡率較高，而灌胃給予環(huán)孢素簡(jiǎn)單易行，符合臨床常規(guī)通過(guò)口服給予環(huán)孢素特點(diǎn)，但低鹽飲食是灌胃給藥復(fù)制慢性環(huán)孢素腎病模型成功的關(guān)鍵［3］。我們的實(shí)驗(yàn)采用低鹽(鈉含量0.046%)飲食1周后灌胃給予環(huán)孢素，結(jié)果4、6周模型組大鼠均出現(xiàn)血肌酐、尿蛋白水平明顯升高，腎臟病理顯示部分腎小管損傷、空泡變性，小管萎縮，并伴炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，小動(dòng)脈玻璃樣變，腎間質(zhì)纖維化，其積分明顯高于對(duì)照組，且出現(xiàn)體重下降、精神萎靡，活動(dòng)差，飲食飲水量下降和毛發(fā)變黃、松亂，部分鼠皮膚可見(jiàn)感染、破潰、膿腫等。

CCN突出病理改變是小管間質(zhì)纖維化，本實(shí)驗(yàn)選用目前公認(rèn)的纖維化指標(biāo)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF－β1)和α－平滑肌肌動(dòng)蛋白(α－SMA)以進(jìn)一步驗(yàn)證，結(jié)果顯示模型鼠腎臟TGF－β1、α－SMA明顯高于對(duì)照組，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)構(gòu)模是成功的，4周成功率為92%，6周成功率約為70%。

對(duì)于慢性環(huán)孢素腎病大鼠模型制作有以下幾點(diǎn)體會(huì):①關(guān)于給藥時(shí)間的選擇:本實(shí)驗(yàn)分別于4周、6周采樣，其4周時(shí)結(jié)果已顯示明顯的腎小管損傷、間質(zhì)纖維化以及腎功能損害和蛋白尿等，而6周時(shí)結(jié)果尤其突出，且實(shí)驗(yàn)大鼠死亡增多、感染率增高，故建議環(huán)孢素4周制作慢性環(huán)孢素模型更合適。②由于CsA為脂溶性藥物，為便于實(shí)驗(yàn)給藥常采用橄欖油作為溶解介質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)設(shè)立橄欖油對(duì)照組，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)與空白對(duì)照組間存在著觀察指標(biāo)的差異，說(shuō)明用橄欖油作為CsA稀釋劑是可行的，但本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)給予作為稀釋劑的橄欖油量過(guò)多(在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)給予環(huán)孢素橄欖油溶液1.5mL/d)時(shí)易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)大鼠腹瀉，既可能影響成模率，也可能影響環(huán)孢素吸收，故稀釋劑橄欖油量不超過(guò)1.5mL為宜。③本實(shí)驗(yàn)分別于2、4、6周觀察大鼠血環(huán)孢素濃度，結(jié)果顯示模型組大鼠環(huán)孢素血藥物明顯偏高，約為人體器官移植后環(huán)孢素血藥物濃度的4～5倍，認(rèn)為與大鼠較人對(duì)環(huán)孢素毒性敏感性差相關(guān)，故需維持較高血藥物濃度才能引起慢性腎損傷作用。且預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)組內(nèi)環(huán)孢素血藥物相差較大，且環(huán)孢素血藥物濃度可能受到某些中藥制劑影響，如某些黃酮類藥物可能致其藥物濃度改變［8］，建議在利用藥物防治CCN動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中可加測(cè)環(huán)孢素血藥物濃度。

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