王文君，向燦輝，霍 靖，羅建飛，孫志勇

(遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)，廣東 珠海 519041)

杜仲皮具有補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨，調(diào)血壓，防衰老，抗腫瘤等功效，對(duì)高血壓具有獨(dú)特療效，被認(rèn)為是最理想的天然降壓藥物之一［1－4］。近年來(lái)研究表明杜仲葉與皮有相似的化學(xué)成分和藥理作用［5－7］，可以代皮供藥用，另外有資料提及，杜仲葉中還含有多種杜仲皮中所沒(méi)有的成分，具有新的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值，而且杜仲屬于落葉喬木，其葉子是可再生的，資源豐富。因此，杜仲皮和杜仲葉綜合開(kāi)發(fā)利用，將有利于擴(kuò)大藥源及藥材的充分利用。我們擬對(duì)杜仲皮和杜仲葉中的黃酮進(jìn)行含量測(cè)定及抗氧化性比較分析，為杜仲黃酮的綜合開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 杜仲皮提取物、杜仲葉提取物(自制)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(成都曼思特生物科技有限公司)，ABTS標(biāo)準(zhǔn)品(美國(guó)Sigma公司)，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

BSA124S電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)，UV－2550型紫外分光光度計(jì)(日本島津)，Scientz－10W冷凍干燥機(jī)(寧新生物科技有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海夏豐實(shí)業(yè)有限公司)，抽濾器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)。

1.2 方法與步驟

1.2.1 杜仲皮、葉粗提物制備［8］杜仲皮、葉，粉碎，過(guò)80目篩，石油醚脫脂，然后用體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇溶液以1∶3料液比超聲浸提30 min，抽濾，濃縮。

1.2.2 粗提物純化 用聚酰胺柱層析法，濕法上樣，以體積分?jǐn)?shù)為15%，30%，55%的乙醇溶液進(jìn)行洗脫，濃縮、凍干，得到固體樣品，杜仲皮的樣品為 S1、S2和 S3，杜仲葉的樣品為 S4、S5和 S6。

1.2.3 TLC 色譜定性分析

1.2.3.1 微乳液展開(kāi)劑色譜法 用十二烷基硫酸鈉:正丁醇:正庚烷按照 3.9∶5.2∶0.91(質(zhì)量比)稱取各試劑，加入適量水，使水的含量達(dá)到70%，配制總量為100g，即為微乳液展開(kāi)劑。用毛細(xì)管在聚酰胺薄膜上點(diǎn)樣，展開(kāi)。

1.2.3.2 正丁醇:冰醋酸:水展開(kāi)劑色譜分析 用正丁醇:冰醋酸:水以4∶1∶2混合作為展開(kāi)劑，用毛細(xì)管在聚酰胺薄膜上點(diǎn)樣，展開(kāi)。

1.2.4 杜仲總黃酮含量測(cè)定 精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品5.0 mg，置于25.00 mL的容量瓶中，加乙醇適量，置于水浴鍋上微熱使蘆丁溶解，放冷，加乙醇至刻度，搖勻，移取對(duì)照品 0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL，分別置于25.00 mL 容量瓶中，各加乙醇10 mL，加5%NaNO2溶液 1.00 mL，搖勻放置8 min，再加10%Al(NO3)3溶液 1.00 mL，搖勻，再放置6 min，加4%NaOH溶液8.00 mL，定容。搖勻放置10～20 min，，以試劑空白作參比，在497 nm處測(cè)定吸光度。樣品也在同樣條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)測(cè)定吸光度。

1.2.5 抗氧化性分析 精密稱取Vc、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品以及各樣品適量，配制成一系列不同濃度的乙醇溶液，分別取各溶液30 μl加入3 mL ABTS+工作液，以無(wú)水乙醇代替樣品加入ABTS+工作液為空白。充分搖勻，靜置3 min后，于734 nm下測(cè)其吸光度A。

2 結(jié)果

2.1 TLC薄層色譜分析結(jié)果

2.1.1 微乳液展開(kāi)劑色譜鑒定結(jié)果 以槲皮素、蘆丁為對(duì)照品，展開(kāi)杜仲葉、杜仲皮提取物，在365nm紫外燈下觀察，蘆丁的比移值為0.43，而樣品在此處均無(wú)斑點(diǎn)，表明皮和葉中都不含有蘆丁。而槲皮素幾乎沒(méi)有展開(kāi)，仍在原點(diǎn)，兩個(gè)樣品在原點(diǎn)也均有斑點(diǎn)，所以樣品中可能都含有槲皮素。此外，葉的樣品在比移值0.14、0.29處出現(xiàn)兩個(gè)斑點(diǎn)表現(xiàn)為紅色熒光，皮的樣品在0.61、0.79處有兩個(gè)斑點(diǎn)。但由于沒(méi)有對(duì)照品，無(wú)法確定物質(zhì)成分。

2.1.2 正丁醇:冰醋酸:水混合展開(kāi)劑色譜鑒定結(jié)果 以槲皮素為對(duì)照品，槲皮素的比移值為0.21，皮和葉的樣品在比移值0.21處也有斑點(diǎn)，表明兩樣品中均含有槲皮素。

2.2 定量分析

2.2.1 繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線 標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為 A=10.525c －0.0414，R2=0.9996，其中 A 為吸光度，c為濃度(mg/mL)。R為線性相關(guān)系數(shù)。從相關(guān)系數(shù)可以確定線性很好，可用于定量分析，線性范圍0.016 ～0.080mg/mL。

2.2.2 樣品總黃酮含量測(cè)定

表1 樣品含量測(cè)定數(shù)據(jù)

每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定了3次，精密度比較好。從結(jié)果可以看出，對(duì)于杜仲皮和葉的純化產(chǎn)物，15%、55%的乙醇提取物黃酮含量彼此接近，而對(duì)于30%的乙醇提取物，杜仲葉的黃酮含量要高于對(duì)應(yīng)的杜仲皮的黃酮含量。由此也可以看出，杜仲葉中同樣富含黃酮，可以作為提取黃酮的原料。同時(shí)，聚酰胺對(duì)杜仲黃酮具有一定的純化能力，但效率有限，最好純度達(dá)到41.50%，需進(jìn)一步研究純化條件。

2.3.1 蘆丁對(duì)照品抗氧化測(cè)定結(jié)果

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品清除ABTS+曲線

2.3.2 Vc對(duì)照品抗氧化測(cè)定結(jié)果

圖2 Vc清除ABTS+曲線

2.3.3 S1的抗氧化測(cè)定結(jié)果

圖3 S1的ABTS+清除曲線

2.3.4 S2的 ABTS+測(cè)定結(jié)果

圖4 S2的 ABTS+清除曲線

2.3.5 S3的 ABTS+測(cè)定結(jié)果

圖5 S3ABTS+清除曲線

2.3.6 S4樣品抗氧化性測(cè)定結(jié)果

圖6 S4樣品清除ABTS+·曲線

2.3.7 S5樣品抗氧化性測(cè)定結(jié)果

圖7 S5樣品清除ABTS+·曲線

2.3.8 S6樣品抗氧化性測(cè)定結(jié)果

圖8 S6樣品清除ABTS+·曲線

從清除率曲線可以看出，所有樣品對(duì)自由基的清除能力均隨著抗氧化劑濃度的增大而增強(qiáng)，并且抗氧化能力隨濃度變化表現(xiàn)出較好的線性關(guān)系。即，所有的樣品均具有一定的抗氧化活性。為了較好的比較杜仲皮和葉中黃酮的抗氧化能力，我們同時(shí)分析了所有樣品的半抑制率(EC50)，EC50值越小，表明該物質(zhì)的抗氧化能力越強(qiáng)，測(cè)定結(jié)果(見(jiàn)表2)。

表2 樣品的EC50數(shù)據(jù)

結(jié)果表明:采用同樣的提取方法、同樣的純化條件，得到的對(duì)應(yīng)樣品的抗氧化活性數(shù)據(jù)很接近，15%的乙醇洗脫產(chǎn)物，皮中黃酮的EC50值為1.948 mg/mL，而葉中黃酮的 EC50值為1.819 mg/mL;30%的乙醇洗脫產(chǎn)物，皮中黃酮的EC50值為2.379 mg/mL，而葉中黃酮的 EC50值為 2.368 mg/mL，兩數(shù)據(jù)非常接近;55%的乙醇洗脫產(chǎn)物，皮中黃酮的EC50值為 3.133 mg/mL，而葉中黃酮的 EC50值為3.312mg/mL。這就說(shuō)明杜仲皮和葉中的黃酮的抗氧化能力很接近，可以以葉代皮使用。但從EC50值也可得出，杜仲皮、葉黃酮的抗氧化活性均弱于Vc和蘆丁對(duì)照品。

3 討論

把杜仲葉和皮的粗提物經(jīng)過(guò)聚酰胺柱層析的相同洗脫段的黃酮含量和抗氧化活性進(jìn)行組間比較發(fā)現(xiàn)，15%、30%的乙醇洗脫產(chǎn)物所得黃酮含量?jī)蓛蓸娱g分別存在顯著性差異，顯著性水平分別為0.042和0.002，均＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。55%的乙醇溶劑洗脫產(chǎn)物所得黃酮含量?jī)蓸娱g不存在顯著性差異，顯著性水平為0.17;15%、30%和55%的乙醇洗脫產(chǎn)物所得黃酮的抗氧化能力兩兩樣間均不存在顯著性差異，顯著性水平分別為0.19、0.90和0.082。從統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)可以說(shuō)明杜仲葉中黃酮和皮中的黃酮含量接近，也有不同，但抗氧化活性是相同的，所以開(kāi)發(fā)葉中的黃酮是有價(jià)值的。研究結(jié)果也表明聚酰胺對(duì)杜仲黃酮具有一定的富集純化能力，但效果有限，純化條件要進(jìn)一步探索。

綜上所述，杜仲葉中含有黃酮，并且和杜仲皮中黃酮的抗氧化活性接近，可以葉代皮使用，擴(kuò)大藥源。杜仲皮和葉中均不含有蘆丁，均含有槲皮素。

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