向 陽 , 胡君健, 鄭學(xué)琴

(1. 湖南理工學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院, 湖南 岳陽 414006; 2. 湖南省血吸蟲病防治研究所, 湖南 岳陽 414006)

東方田鼠抗日本血吸蟲病CD74基因的差異表達(dá)及生物信息學(xué)分析

向 陽1, 胡君健2, 鄭學(xué)琴1

(1. 湖南理工學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院, 湖南 岳陽 414006; 2. 湖南省血吸蟲病防治研究所, 湖南 岳陽 414006)

利用日本血吸蟲尾蚴感染東方田鼠, 提取感染前和感染后10d 和15d東方田鼠肝臟組織總RNA; 利用大鼠CD74基因探針, 經(jīng)Rorthern雜交分析東方田鼠感染日本血吸蟲前及感染血吸蟲10 d、15 d后肝臟組織CD74的差異表達(dá)情況;同時(shí), 采用生物信息學(xué)分析大鼠CD74基因的cDNA序列及其編碼的氨基酸序列以及CD74蛋白的結(jié)構(gòu)域. 結(jié)果顯示: 東方田鼠感染日本血吸蟲感染血吸蟲10 d、15 d后肝臟組織CD74的表達(dá)水平比感染前顯著升高; 大鼠CD74基因的cDNA序列全長1220bp, 編碼216個(gè)氨基酸殘基; 大鼠CD74蛋白含一個(gè)MHC2相互作用超家族結(jié)構(gòu)域和一個(gè)MHCassoc_trimer超家族結(jié)構(gòu)域.

東方田鼠; 日本血吸蟲;CD74; 差異表達(dá); 生物信息學(xué)分析

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物

東方田鼠為室內(nèi)繁殖的湖南洞庭湖種, 由湖南省血吸蟲病防治研究所提供.

1.1.2 日本血吸蟲尾蚴

由湖南省血吸蟲病防治研究所提供新鮮逸出的日本血吸蟲尾蚴, 進(jìn)行人工定量感染試驗(yàn).

1.2 方法

1.2.1 組織樣品收集和RNA 提取

用1000條日本血吸蟲尾蚴感染東方田鼠, 于感染10d 和15d后取東方田鼠肝臟組織及陽性對照, 提取總RNA見文獻(xiàn)[18].

1.2.2 Northern雜交實(shí)驗(yàn)

探針制備及Northern雜交見文獻(xiàn)[19]. 本實(shí)驗(yàn)芯片雜交實(shí)驗(yàn)操作如下: 分別利用大鼠CD74基因探針與未感染的東方田鼠和感染10d和15天后的東方田鼠肝組織樣品mRNA雜交.

1.2.3 生物信息學(xué)分析

美國國家生物信息中心NCBI EST數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和Unigene數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm. nih.gov/Unigene). 閱讀框架的識別: 利用ExPASy服務(wù)器中的 Translate和NCBI中的ORF finder. 結(jié)構(gòu)域分析: 利用NCBI中BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)的protein blast.

2 結(jié)果

2.1 感染日本血吸蟲前后東方田鼠肝臟組織RNA抽提

抽提東方田鼠感染日本血吸蟲前及感染10 d、15 d后肝組織總RNA. 按《分子克隆》說明抽提, 每條泳道上上樣mRNA約3 μg (圖1).

圖1 東方田鼠感染日本血吸蟲前后肝臟組織總RNA抽提結(jié)果

2.2 東方田鼠正常對照組與感染日本血吸蟲10 d、15 d后肝組織CD74的差異表達(dá)

利用大鼠CD74基因探針, 經(jīng)Rorthern雜交分析, 東方田鼠感染日本血吸蟲10 d、15 d后肝組織CD74的表達(dá)比正常對照組顯著上調(diào)(圖2).

圖2 Northern blot分析CD74

2.3 CD74 基因完整閱讀框的生物信息學(xué)分析

大鼠CD74基因的cDNA 序列全長1220bp, 編碼216個(gè)氨基酸殘基(圖3).

圖3 大鼠CD74基因的cDNA序列及其編碼的氨基酸序列

2.4 CD74 蛋白結(jié)構(gòu)域的生物信息學(xué)分析

大鼠CD74蛋白含216個(gè)氨基酸殘基,含一個(gè)MHC2相互作用超家族結(jié)構(gòu)域和一個(gè)MHCassoc_trimer超家族結(jié)構(gòu)域(圖4).

圖4 大鼠CD74蛋白結(jié)構(gòu)域分析

3 討論

血吸蟲病是繼瘧疾之后的全球第二大寄生蟲病, 嚴(yán)重危害人類健康. 中國是血吸蟲病的重災(zāi)區(qū)之一. 我國流行的主要是日本血吸蟲病, 全國累計(jì)患者達(dá)1161.2萬人, 受血吸蟲病威脅的人口達(dá)1.3億. 東方田鼠具有天然抗日本血吸蟲能力, 是日本血吸蟲的非適宜性宿主.利用大鼠CD74基因探針與未感染日本血吸蟲尾蚴的東方田鼠和感染日本血吸蟲尾蚴后第10 d和15d的東方田肝組織mRNA雜交, 感染10 d和15d肝臟內(nèi)CD74基因的表達(dá)顯著上調(diào), CD74作為一種跨膜蛋白是巨噬細(xì)胞遷移抑制因子( macrophage m igration inh ib itory factor, M IF)的受體分子參與免疫免疫調(diào)節(jié), 表明東方田鼠感染日本血吸蟲后機(jī)體免疫系統(tǒng)得到積極應(yīng)答. 同時(shí), 本文對大鼠CD74基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,CD74全長1220bp, 編碼216個(gè)氨基酸殘基, 含含一個(gè)MHC2相互作用超家族結(jié)構(gòu)域和一個(gè)MHCassoc_trimer超家族結(jié)構(gòu)域. 本研究為進(jìn)一步研究CD74在東方田鼠抗日本血吸蟲病防治中的作用奠定了一定基礎(chǔ).

[1] He Y, Luo X, Zhang X, et al.Immunological characteristics of natural resistance in Microtus fortis to infection with Schistosoma japonicum[J]. Chin Med J.1999, 112(7): 649～654

[2] 鄒國軍, 胡維新. 東方田鼠天然抗日本血吸蟲病機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 中國地方病學(xué)雜志, 2006, 25 (2): 227～228

[3] 俞遠(yuǎn)京, 胡維新, 王 勇, 等. 野生東方田鼠實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化及種質(zhì)資源保護(hù)的初步研究[J]. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)與管理, 2003, 20: 13～17

[4] 李 浩, 何艷燕, 林邦發(fā), 等. 東方田鼠重復(fù)感染日本血吸蟲試驗(yàn)初步研究[J]. 中國獸醫(yī)寄生蟲病, 2001, 9(3): 11～17

[5] 劉杰生, 容壽銘, 陳佩璣, 等. 幾種鼠類人工感染日本血吸蟲的實(shí)驗(yàn)觀察[J]. 中國血吸蟲病防治雜志, 1992,4( 6): 350～351

[6] 劉金明, 傅志強(qiáng), 李 浩, 等. 東方田鼠血清體外殺傷日本血吸蟲童蟲效果的初步觀察[J]. 中國人獸共患病雜志, 2002, 18(2): 82～84

[7] 蔣守富, 邱倩雯, 何艷燕, 等. 東方田鼠血清蛋白組分體外殺傷日本血吸蟲童蟲作用的研究[J]. 中國血吸蟲病防治雜志, 2008, 20(4):260～264

[8] 蔣守富, 魏梅雄, 林矯矯, 等. 東方田鼠IgG3 抗體抗血吸蟲病作用研究[J]. 中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志, 2008, 26 (10): 34～36

[9] 閻玉濤, 劉述先, 宋光承, 等. 東方田鼠天然抗體相關(guān)的日本血吸蟲抗原基因篩選和克隆[J]. 中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志, 2001, 19(3): 153～156

[10] 袁忠英, 沈玉娟, 曹建平, 等. 東方田鼠血清免疫篩選日本血吸蟲童蟲cDNA文庫及新基因分析[J]. 中國血吸蟲病防治雜志, 2008, 20(4): 552-556

[11] 孫 毅, 孫 煥, 賈人初, 等. 東方田鼠抗日本血吸蟲抗性相關(guān)靶基因篩選[J]. 中國血吸蟲病防治雜志, 2008, 20(1): 26～31

[12] 秦志強(qiáng), 胡維新, 鄔國軍, 等. 東方田鼠骨髓基因池的構(gòu)建及抗日本血吸蟲抗性相關(guān)基因的篩選[J]. 生命科學(xué)研究, 2004, 8(4): 333～338

[13] 孫 軍, 林矯矯, 程國鋒, 等. 利用基因表達(dá)譜芯片研究東方田鼠和小鼠感染日本血吸蟲前后基因的差異性表達(dá)[J]. 北京大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版) , 2004, 40(4): 532～537

[14] K leemann R, H ausserA, Ge ige rG, et al.Intracellular action o f the cytokine M IF to m odu late AP1 activity and the cell cycle through Jab1[J].Nature, 2000, 408 ( 6809): 211～216

[15] M cC lellandM, Zhao LJ, Carskadon S, et al.Expression o f CD74, the recepto r form acrophage mig- ration inhibitory factor, innonsma ll cell lung cancer[J] . Am J Patho, 2009, 174( 2): 638～646

[16] Cho YS, Jones BF, Verm e ire JJ, et al.Structural and functiona l character ization of a secreted hookworm m acrophage m igration inh ib itory factor (M IF) that interacts w ith the humanM IF receptor CD74[ J] . J Biol Chem, 2007, 282 ( 32): 23447～23456

[17] Dobson SE, Augustijn KD, B rann igan JA, et al.The crysta l structures o fm acrophage migration inh- ibitory factor from Plasmodium falciparum and Plasmodium berghei[J] . Protein Sci, 2009, 18( 12) : 2578～2591

[18] Y. XIANG, D. S. NIE, Q. J. ZHANG,et al..Cloning, characterization and identification of Rcet1-v1 and Rcet1-v2, two novel splice variants of mouse Rcet1 related to Cres subgroup of family 2 cystatins[J]. DNA sequence the journal of DNA sequencing and mapping, 2008,19(1): 13～19

[19] Yang XIANG, Dong-Song NIE, Jian WANG, et al..Cloning, Characterization and Primary Function Study of a Novel Gene, Cymg1, Related to Family 2 Cystatins[J]. Acta Biochimica et Biophysica Sinica, 2005, 37(1): 11～18

Different Expression and Bioinformatic Analysis of Microtus Fortis in Anti- Schistosomiasis Japonica CD74 Gene

XIANG Yang1, HU Jun-jian2, ZHENG Xue-qin1
(1. College of Chemistry and Chemical Engineering, Hunan Institute of Science and Technology, Yueyang 414006, China; 2. Hunan Provincial Institute of Schistosomiasis Control, Yueyang 414006, China )

The total RNA was extracted from microtus fortis liver tissue which was infected of the schistosoma japonicum cercariae before infection and after infection 10d and 15d. Using rattus norvegicusCD74gene probe to hybridize analysis ofCD74difference expression in the microtus fortis liver tissues which were infected with Schistosoma japonicum before infection and after infection 10 d, 15 d. At the same time, bioinformatics analysis of the cDNA sequence and encoded amino acid sequence of the rattus norvegicusCD74gene and CD74 protein structural domains. The results showed: after microtus fortis infected with schistosoma japonicum 10 d and 15 d the liver tissue ofCD74expression levels significantly higher than pre-infection; rattus norvegicusCD74cDNA sequence of a total length is 1220bp and encode 216 amino acid residues; rattus norvegicus CD74 protein containing a MHC2 interaction domain of the superfamily and a MHCassoc_trimer superfamily domain.

microtus fortis; schistosoma japonicum;CD74; differences in expression; bioinformatic analysis

Q752

A

1672-5298(2012)02-0044-03

血吸蟲病是繼瘧疾之后的全球第二大寄生蟲病, 嚴(yán)重危害人類健康. 全球至少有76個(gè)國家和地區(qū)受到危害, 約有6億人受到威脅, 2億人被感染, 而中國是血吸蟲病的重災(zāi)區(qū)之一. 我國流行的主要是日本血吸蟲病, 全國累計(jì)患者達(dá)1161.2萬人, 受血吸蟲病威脅的人口達(dá)1.3億. 我國血吸蟲病主要分布在江蘇、湖南、湖北、四川和云南等省, 洞庭湖區(qū)為全國重災(zāi)區(qū)之一, 感染人群占全國的1/4. 東方田鼠 (Microtus fortis) 是日本血吸蟲的非適宜宿主, 具有天然完全抗日本血吸蟲病的特性[1]. 東方田鼠在我國的分布主要集中在長江流域, 特別是在日本血吸蟲病流行的洞庭湖湖洲, 是該地域的一個(gè)優(yōu)勢鼠種[2]. 日本血吸蟲感染東方田鼠后第12天開始, 蟲體生長發(fā)育停滯, 第20～28天蟲體在體內(nèi)全部消亡[3], 日本血吸蟲在東方田鼠體內(nèi)的消亡部位主要是肝臟[4]. 實(shí)驗(yàn)表明: 鼠類中, 黃毛鼠、板齒鼠、海南屋頂鼠、黃胸鼠、大鼠對日本血吸蟲的易感性由高到低[5], 大鼠為日本血吸蟲非適宜性宿主. 這揭示了不同鼠種對日本血吸蟲有不同的抵抗能力. 至今, 幾乎所有的血吸蟲感染動(dòng)物模型都是陽性模型, 而東方田鼠感染血吸蟲模型卻是一種陰性模型. 因此, 利用東方田鼠天然抗日本血吸蟲感染的動(dòng)物模型, 我國科學(xué)家對東方田鼠的體液免疫和細(xì)胞免疫[6～8]、天然抗體相關(guān)抗原基因[9～11]、抗病基因的篩選[12]、利用基因表達(dá)譜芯片篩選東方田鼠感染日本血吸蟲前后的差異基因[13]及功能研究等做了大量的研究工作. CD74作為一種跨膜蛋白是巨噬細(xì)胞遷移抑制因子( macrophage m igration inh ib itory factor,M IF)的受體分子, 與多種人類自身疾病的發(fā)生和寄生蟲的感染相關(guān)[14], 可在57 種腫瘤細(xì)胞中檢測到CD74基因的高表達(dá), 并且是以CD74-M IF 復(fù)合體的方式存在[15]; CD74還可與寄生蟲來源的M IF 相互作用, 其結(jié)合機(jī)制以及相互作用后在調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞效應(yīng)方面與宿主M IF均有不同[16,17]. 本文比較了東方田鼠感染日本血吸蟲前后CD74的差異表達(dá)及對CD74進(jìn)行了生物信息學(xué)分析, 為進(jìn)一步研究CD74在東方田鼠抗日本血吸蟲病的機(jī)理打下了一定基礎(chǔ).

2012-04-10

湖南省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(09A035); 湖南省衛(wèi)生廳一般項(xiàng)目(B2009-102)

向 陽(1968- ), 男, 湖南懷化人, 博士, 湖南理工學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院教授. 主要研究方向: 分子生物學(xué)