劉海莉 張 野 李 穎 白雪帆 賈戰(zhàn)生 王九平

新近研究發(fā)現(xiàn)，E3泛素連接酶家族成員Casitas B-lineage lymphoma-b（Cbl-b）調(diào)控著外周血T細(xì)胞的活化閾值和CD28共刺激信號通路，可能在復(fù)雜的免疫網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中處于重要的地位[1]，Cbl-b的表達(dá)水平改變對T細(xì)胞功能也會產(chǎn)生重要的影響，高水平表達(dá)的Cbl-b可誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫無功能，發(fā)揮負(fù)性免疫調(diào)控作用，可能導(dǎo)致機(jī)體的免疫耐受[2，3]。但是，尚無有關(guān)Cbl-b與HCV感染慢性化的相關(guān)研究報告。本研究通過對慢性丙型肝炎患者外周血Cbl-b及其相關(guān)調(diào)控信號分子CD28和細(xì)胞溶解性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（cytotoxic T-lymphocyte antigen-4，CTLA-4）水平的測定，以探討HCV感染慢性化的機(jī)制。

資料與方法

一、資料來源 2010年11月至2011年6月我科收治的慢性丙型肝炎患者25例，男性12例，女性13例，平均年齡43.6±11.8歲。所有患者抗HCV均為陽性，HCV RNA載量范圍為 70100copies/mL～1470000copies/mL，ALT水平范圍為 23U/L～92 U/L，其中HCV 1b基因型11例，HCV 2a基因型14例。診斷符合2000年中華醫(yī)學(xué)會西安會議修訂的《病毒性肝炎防治方案》的標(biāo)準(zhǔn)[4]，排除其他肝炎病毒合并感染及合并自身免疫性、酒精性和藥物性肝病，排除腫瘤、心血管疾病及其它感染性疾病。所有患者均未接受過抗病毒和免疫調(diào)節(jié)劑治療。另選健康人19例作為健康對照，男性9例，女性10例，平均年齡35.6±4.7歲。所有健康志愿者血清HCV RNA和抗HCV均為陰性，ALT水平均＜40U/L。本研究方案經(jīng)我院倫理委員會審批備案，所有入組患者和健康志愿者均簽署知情同意書。

二、臨床指標(biāo)檢測 采用熒光定量RT-PCR法檢測HCV RNA（深圳匹基生物技術(shù)開發(fā)有限公司）；采用INNO-LiPA線性探針雜交法檢測HCV基因分型（比利時Innogenetics公司）；采用日本奧林巴斯全自動生化分析儀檢測肝功能（英國郎道公司）。

三、外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood monouclear cells，PBMC）分離 應(yīng)用EDTA抗凝管采集入組患者和健康志愿者外周靜脈血20mL，2小時內(nèi)應(yīng)用美國Sigma公司生產(chǎn)的淋巴細(xì)胞分離液，采用密度梯度離心法分離PBMC，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至107個/管，凍存于液氮中備用。檢測前24小時復(fù)蘇細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至5×106個/mL，于37℃、5%CO2條件下在含10%胎牛血清的RPMI1640中培養(yǎng)。

四、反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR檢測Cbl-b、CD28和CTLA-4的表達(dá) 收集細(xì)胞，使用美國Invitrogen公司的Trizol試劑參照說明書提細(xì)胞總RNA，用DEPC處理的去離子水溶解RNA并進(jìn)行定量。取1μg總RNA，使用大連TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒應(yīng)用隨機(jī)引物合成cDNA。以cDNA為模版，加入引物（表1）和大連TaKaRa公司SYBR Master Mix熒光定量PCR試劑盒對相應(yīng)的目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，預(yù)變性95℃ 15秒后，95℃ 5秒、60℃ 30秒，共45個循環(huán)。應(yīng)用2－ΔΔCT法對目的基因進(jìn)行相對定量分析。

表1 寡核苷酸引物序列

結(jié)果

一、健康人和慢性丙型肝炎患者PBMC Cbl-b、CD28和CTLA-4 mRNA相對表達(dá)水平的比較 慢性丙型肝炎患者外周血PBMC Cbl-b、CD28和CTLA-4 mRNA水平均較健康對照組分別升高1.38倍、1.90倍和2.68倍（圖1），其中，CTLA-4在慢性丙型肝炎組中的升高與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.314，P=0.028）。

圖1 兩組PBMC Cbl-b、CD28和CTLA-4 mRNA相對表達(dá)水平

二、Cbl-b、CD28和CTLA-4 mRNA水平與臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析 在慢性丙型肝炎患者中，HCV 1b基因型患者外周血Cbl-b、CD28和CTLA-4 mRNA水平較2a基因型分別升高1.74倍、1.51倍和2.81倍，其中 Cbl-b（t=2.241，P=0.04）和 CTLA-4（t=2.569，P=0.022）的升高具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖2）。但是，Cbl-b、CD28和CTLA-4 mRNA水平與HCV RNA及ALT水平均無顯著相關(guān)性（Cbl-b與HCV RNA：r=-0.343，P=0.301；Cbl-b 與 ALT：r=-0.106，P=0.756；CD28 與HCV RNA：r=-0.009，P=0.979；CD28 與 ALT：r=-0.459，P=0.156；CTLA-4 與 HCV RNA：r=-0.484，P=0.131；CTLA-4 與 ALT：r=0.469，P=0.145）。

討論

泛素是一種含有76個氨基酸的肽段。Cbl-b是E3泛素連接酶的重要成員，可作為銜接分子與細(xì)胞表面受體、細(xì)胞內(nèi)蛋白或某些重要的信號分子結(jié)合，控制抗原受體活化的閾值和CD28共刺激信號的負(fù)性調(diào)控[4，5]。

Cbl-b在一些感染性疾病中也發(fā)揮重要作用。Cbl-b和CTLA-4在HIV感染者PBMC中表達(dá)均上調(diào)，同時，作為T細(xì)胞活化的上游負(fù)性調(diào)控分子，Cbl-b的表達(dá)上調(diào)使T細(xì)胞活化的閾值升高，CD4+和CD8+細(xì)胞對抗CD3單克隆抗體均不產(chǎn)生反應(yīng)，細(xì)胞增殖能力下降，導(dǎo)致T細(xì)胞反應(yīng)下降或失能[6]。蠕蟲或絲蟲感染者CTLA-4上調(diào)和轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）刺激后Cbl-b水平升高，可能導(dǎo)致感染后T細(xì)胞低反應(yīng)性[7，8]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，慢性丙型肝炎患者PBMC中Cbl-b、CD28和CTLA-4均具有表達(dá)上調(diào)的趨勢，但僅有CTLA-4的升高與對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義。由于CTLA-4是CD28的拮抗分子，可通過與B7分子的高親和力結(jié)合，競爭性抑制CD28與B7分子的相互作用，抑制T細(xì)胞活化的第二信號。而Cbl-b的表達(dá)受CD28和CTLA-4的精密調(diào)節(jié)，B7分子與CD28結(jié)合可誘導(dǎo)Cbl-b泛素化并降解，降低細(xì)胞內(nèi)Cbl-b水平，增強(qiáng)T細(xì)胞增殖；相反，B7分子與CTLA-4結(jié)合則可上調(diào)Cbl-b表達(dá)，從而抑制T細(xì)胞增殖[9]。

進(jìn)一步的研究也發(fā)現(xiàn)，雖然Cbl-b、CD28和CTLA-4的表達(dá)與HCV RNA和ALT水平?jīng)]有顯著相關(guān)性。但是，在HCV 1b基因型患者PBMC中Cbl-b和CTLA-4表達(dá)則顯著高于HCV 2a基因型患者。干擾素聯(lián)合利巴韋林治療慢性丙型肝炎患者HCV病毒清除率在1型HCV感染者中較2型或3型HCV感染者明顯偏低，而我們既往的研究也發(fā)現(xiàn)HCV 1b基因型患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）水平較HCV 2a基因型患者顯著升高，提示HCV 1b基因型感染者機(jī)體處于較強(qiáng)的免疫耐受狀態(tài)，T細(xì)胞反應(yīng)性較低。而CTLA-4是Treg和免疫失能T細(xì)胞的組成性表達(dá)分子[6，10]，提示CTLA-4在HCV 1b基因型可能也參與上調(diào)Cbl-b的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)T細(xì)胞低反應(yīng)性。因此，HCV感染可能通過上調(diào)CTLA-4的表達(dá)，進(jìn)一步調(diào)節(jié)Cbl-b的表達(dá)水平，誘導(dǎo)機(jī)體免疫耐受，Cbl-b和CTLA-4可能在HCV感染慢性化中發(fā)揮重要作用。

[1]Huang F，Gu H.Negative regulation of lymphocyte development and function by the Cbl family of proteins.Immunol Rev，2008，224:229-238.

[2]Bachmaier K，Krawczyk C，Kozieradzki I，et al. Negative regulation of lymphocyte activation and autoimmunity by the molecular adaptor Cbl-b.Nature，2000，403（6766）:211-216.

[3]Gomez-martin D，Diaz-zamudio M， Alcocer-varela J.Ubiquitination system and autoimmunity:the bridge towards the modulation of the immune response.Autoimmun Rev，2008，7（4）:284-290.

[4]中華醫(yī)學(xué)會傳染病與寄生蟲病學(xué)分會、肝病學(xué)分會.病毒性肝炎防治方案. 中華肝臟病雜志，2000，8（6）:324-329.

[5]Liu YC.Ubiquitin ligases and the immune response.Annu Rev Immunol，2004，22:81-127.

[6]Krawczyk CM，Jones RG，Atfield A，et al.Differential control of CD28-regulated in vivo immunity by the E3 ligase Cbl-b.J Immunol，2005，174（3）:1472-1478.

[7]Loeser S，Penninger JM.Regulation of peripheral T cell tolerance by the E3 ubiquitin ligase Cbl-b.Semin Immunol，2007，19（3）:206-214.

[8]Macian F.NFAT proteins:key regulators of T-cell development and function.Nat Rev Immunol，2005，5（6）:472-484.

[9]Leng Q，Borkow G，Bentwich Z.Attenuated signaling associated with immune activation in HIV-1-infected individuals.Biochem Biophys Res Commun，2002，298（4）:464-467.

[10]Babu S，Blauvelt CP，Kumaraswami V，et al. Regulatory networks induced by live parasites impair both Th1 and Th2 pathways in patent lymphatic filariasis:implications for parasite persistence.J Immunol，2006，176（5）:3248-3256.