劉曉宇 周 莉 段鐘平 趙彩彥

阿德福韋酯于2002年由美國(guó)食品藥品管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)上市用于治療慢性乙型肝炎（CHB），至2008年，全世界服用阿德福韋酯的患者大約為41萬(wàn)人/年，并于2008年被批準(zhǔn)用于12～17歲兒童患者[1]。阿德福韋酯在細(xì)胞激酶的作用下被磷酸化為有活性的代謝產(chǎn)物即阿德福韋酯二磷酸鹽，后者通過(guò)與自然底物脫氧腺苷三磷酸鹽競(jìng)爭(zhēng)或是整合到病毒DNA后引起DNA鏈延長(zhǎng)終止而發(fā)揮抗病毒作用[2]。一般情況下，阿德福韋酯不會(huì)影響人類DNA復(fù)制和修復(fù)，但若長(zhǎng)期應(yīng)用，隨著藥物濃度的不斷積聚，仍可能對(duì)DNA聚合酶γ產(chǎn)生一定的毒性作用。該酶是線粒體復(fù)制中的關(guān)鍵酶。因此，該酶受損后，勢(shì)必會(huì)影響到線粒體的數(shù)量和功能。

阿德福韋酯的主要不良反應(yīng)是可引起腎小管腎病，而腎毒性發(fā)生率與藥物劑量相關(guān)。當(dāng)藥物劑量≥30mg/d時(shí)，其腎病的發(fā)生率為22%～50%，而藥物劑量在10mg/d時(shí)，其發(fā)生率與安慰劑相似。腎毒性的發(fā)生機(jī)制可能與藥物對(duì)線粒體的毒性有關(guān)[3]。Tanji N等[4]對(duì)阿德福韋酯相關(guān)性腎損害患者腎臟的超微結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，近端小管線粒體腫大、變形，線粒體DNA數(shù)量明顯減少，細(xì)胞色素C氧化酶缺乏，細(xì)胞氧化和呼吸功能喪失。Izzedine H等[5]認(rèn)為腎小管部位較高濃度的阿德福韋酯可抑制腎細(xì)胞線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）的合成，從而導(dǎo)致近曲小管mtDNA損耗，線粒體功能明顯降低，影響腎小管的重吸收和分泌功能。嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致腎小管細(xì)胞凋亡，臨床上表現(xiàn)為近曲小管功能障礙。研究表明，長(zhǎng)期服用核苷類似物引起的乳酸酸中毒、脂質(zhì)代謝紊亂、橫紋肌溶解、胰腺炎和周圍神經(jīng)病變等不良反應(yīng)均與線粒體病變有關(guān)[6～10]。

外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood monouclear cells，PBMCs）中mtDNA在一定程度上能夠反應(yīng)組織mtDNA的改變。吳亞松等[11，12]研究指出，發(fā)生脂質(zhì)代謝紊亂的AIDS患者PBMCs中mtDNA含量比未發(fā)生脂質(zhì)代謝紊亂的患者顯著降低。由于PBMCs中線粒體較組織中易于獲得，因此可用其來(lái)監(jiān)測(cè)線粒體的損傷情況。本研究觀察了服用阿德福韋酯3年以上的65例CHB患者PBMCs中線粒體的損傷情況。

資料與方法

一、研究對(duì)象 選自2010年7月～2011年3月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院門診就診的未經(jīng)抗病毒治療或接受阿德福韋酯單藥治療的CHB患者，診斷均符合2000年病毒性肝炎防治方案[13]，其中對(duì)照組22例，為首次發(fā)病，尚未進(jìn)行過(guò)抗病毒治療（對(duì)照組）；阿德福韋酯單藥連續(xù)治療2年組18例（2年組）；阿德福韋酯單藥連續(xù)治療3年組25例（3年組）。排除合并甲、丙、丁、戊型肝炎病毒感染及藥物性、自身免疫性、酒精性肝損害和肝硬化患者。

二、觀察指標(biāo) 使用OLYMPUS AU5400全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血生化指標(biāo)；采用熒光PCR法檢測(cè)血清HBV DNA含量（羅氏試劑盒和羅氏COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan48分析儀）；采用ELISA法檢測(cè)血漿丙二醛（malondialdehyde，MDA）和F2-isoprostanes含量（上海Blue Gene公司）；采用分光光度法檢測(cè)血漿總抗氧化能力（total antioxidant capability，TAOC）含量（南京建成試劑和上海尤尼柯儀器有限公司生產(chǎn)的UV-2600型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)）。

三、PBMCs中mtDNA的提取和測(cè)定 取9ml EDTA抗凝靜脈血，1h內(nèi)常規(guī)方法分離PBMCs，計(jì)數(shù)。取約1×106個(gè)細(xì)胞，用DNA提取試劑盒（德國(guó) QIAGEN公司）提取DNA，以線粒體編碼的基因細(xì)胞色素C氧化酶Ⅱ（coxⅡ）的拷貝數(shù)作為mtDNA拷貝數(shù)，磷酸甘油醛脫氫酶為核DNA（nuclear DNA，nDNA）內(nèi)參照。采用mtDNA/nDNA表示mtDNA含量。其中PCR引物和探針（美國(guó)Invitrogen公司）序列為：mtDNA cox II引物：上游5'-TATCTTTTGGCGGTATGCACTTTTAACAGT-3'， 下 游 5'-TGATGAGATTAGTAGTATGGGAGTGG-3'， 探 針 5'-FAM-CACCCCCCAACTAACACATTATTTTCCCC-TAMRA-3'；核DNA引物：上游 5'-GCCATCCTGCGTCTGGACCTGGCT-3'，下 游 5'-TGATGACCTGGCCGTCAGGCAGCTC-3'，探針 5'-FAM-GCCGGGACCTGACTGACTACCTCATGA-TAMRA-3'。試劑購(gòu)自美國(guó)ABi公司，所用儀器為Step One Plus Real-time PCR儀，分析軟件為Step One Plus software（美國(guó)AB公司）。

表1 各組人群基線情況

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用方差分析法進(jìn)行組間差異的比較。計(jì)數(shù)資料采用x2檢驗(yàn)或Fisher’s確切概率法進(jìn)行組間差異的比較。應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、各組人群基線情況 各組患者性別比例、年齡、HBsAg陽(yáng)性持續(xù)時(shí)間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。三組ALT、AST和HBV DNA水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F/2 值分別為 26.972，15.667，16.865，P值分別為0.000，0.000，0.000）。進(jìn)一步比較服用阿德福韋酯2年和3年組結(jié)果顯示，ALT、AST和HBV DNA差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0.716，0.757，0.927，均＞0.05），見(jiàn)表1。

二、3組患者PBMCs中mtDNA水平和有關(guān)指標(biāo)的比較 見(jiàn)表2。

表2 各組有關(guān)指標(biāo)（）的比較

表2 各組有關(guān)指標(biāo)（）的比較

與對(duì)照組比，①P＜0.05

血清TAOC（單位/毫升）對(duì)照組 1.4±1.2 10.4±6.7 3.7±2.7 4.3±1.8 2年組 0.6±0.4① 8.1±4.7 1.5±0.8① 3.0±1.1①3年組 0.8±0.5① 6.7±3.2 2.2±1.3① 2.3±1.4①F 5.878 2.404 7.300 10.888 P 0.005 0.099 0.001 0.000 PBMCs mtDNA（copies/cell）血清MDA（ng/ml）F2-isoprostanes（ng/ml）

三、不良反應(yīng) 用藥期間各組患者均未見(jiàn)明顯不良反應(yīng)。

討論

線粒體是一種半自主細(xì)胞器，可獨(dú)立于核DNA之外自主地進(jìn)行復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯。mtDNA由16 569bp組成，編碼2個(gè)rRNA基因（16SrRNA，12SrRNA），22個(gè)tRNA基因，13個(gè)蛋白基因（包括1個(gè)細(xì)胞色素b基因，2個(gè)ATP酶亞單位基因和7個(gè)呼吸鏈脫氫酶亞單位基因）。mtDNA能合成自身所需的一部分蛋白質(zhì)，線粒體中大部分蛋白質(zhì)是核基因編碼的。閾值效應(yīng)是指當(dāng)mtDNA突變達(dá)到一定比例時(shí)，才會(huì)出現(xiàn)受損表型；由于mtDNA缺乏修復(fù)系統(tǒng)及組蛋白保護(hù)，所以易受活性氧等自由基的侵害而突變率高。mtDNA可通過(guò)母系遺傳。線粒體的生命周期有限，平均壽命約為10天，具有較高的更新率，需不斷復(fù)制。因此，當(dāng)藥物濃度高達(dá)能夠抑制HBV DNA聚合酶γ時(shí)，則會(huì)導(dǎo)致線粒體合成減少，從而誘導(dǎo)突變的發(fā)生，但只有當(dāng)損害達(dá)一定程度時(shí)才會(huì)出現(xiàn)受損表型[17]。

線粒體是細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化和形成三磷酸腺苷（ATP）的主要場(chǎng)所，也是調(diào)控細(xì)胞凋亡和活性氧產(chǎn)生的重要部位。當(dāng)線粒體異?；驕p少達(dá)一定程度時(shí)即可影響其氧化磷酸化功能，使ATP生成減少，活性氧生成增加，出現(xiàn)細(xì)胞功能障礙或細(xì)胞凋亡。在體外試驗(yàn)中，許多抗HBV核苷（酸）類似物在高于人體治療劑量10～100倍時(shí)可表現(xiàn)出線粒體毒性。

本研究發(fā)現(xiàn)，服用阿德福韋酯2年后，mtDNA含量已經(jīng)減少，但繼續(xù)服用阿德福韋酯1年，mtDNA含量則無(wú)進(jìn)一步下降。已有研究表明，HBV本身會(huì)影響線粒體功能。張樹林等[14]研究發(fā)現(xiàn)HBV侵犯PBMCs可致線粒體功能降低，能量代謝異常。Tan C等[15]研究指出HBV復(fù)制會(huì)引起線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔開放，導(dǎo)致鈣外流，引發(fā)細(xì)胞凋亡。Lin N等[16]報(bào)道HBV可以下調(diào)細(xì)胞色素C氧化酶II表達(dá)，抑制線粒體細(xì)胞色素C氧化酶活性，導(dǎo)致氧自由基產(chǎn)生增多。Stankov MV[17]等在研究核苷（酸）類似物對(duì)人皮下脂肪組織中mtDNA缺失和呼吸鏈功能的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，mtDNA缺失達(dá)50%時(shí)，呼吸功能仍不會(huì)受到影響。而HBV本身已經(jīng)損傷了線粒體功能，也就是說(shuō)，HBV的作用可導(dǎo)致mtDNA大量減少。

在核苷類似物治療AIDS患者的研究中發(fā)現(xiàn)，短時(shí)間用藥可以改善PBMCs中mtDNA含量，長(zhǎng)時(shí)間用藥會(huì)導(dǎo)致mtDNA數(shù)量下降[18，19]，這與本研究結(jié)果有所不同。本實(shí)驗(yàn)阿德福韋酯用量為10mg/d，服藥達(dá)3年時(shí)或許尚未達(dá)到毒性濃度，且線粒體的損傷存在閾值效應(yīng)。因此，尚不能確定更長(zhǎng)時(shí)間用藥對(duì)線粒體的損傷情況，需要進(jìn)一步觀察。

本研究發(fā)現(xiàn)，服藥2年時(shí)，患者血F2-isoprostanes較對(duì)照組顯著降低。F2-isoprostanes是自由基催化生物膜上的花生四烯酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化（非酶促反應(yīng)）后的特異性產(chǎn)物，不受飲食的影響，能靈敏準(zhǔn)確地反映體內(nèi)氧化應(yīng)激水平，并與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)，是評(píng)估脂質(zhì)過(guò)氧化最可靠的生化指標(biāo)[20]。我們推測(cè)，HBV導(dǎo)致的線粒體損傷遠(yuǎn)大于阿德福韋酯對(duì)線粒體復(fù)制的抑制。加之，只有當(dāng)線粒體減少達(dá)一定比例時(shí)，才會(huì)導(dǎo)致其功能的異常[17]。

機(jī)體有酶類和非酶類兩大抗氧化防御體系，各抗氧化劑之間既有協(xié)同作用又有相互依賴和保護(hù)作用。TAOC代表機(jī)體實(shí)際抗氧化能力的總和，能比單一抗氧化劑提供更準(zhǔn)確的信息[21]。MDA是氧自由基與生物膜上的多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化的最終產(chǎn)物，但不是特異性產(chǎn)物。MDA可與DNA和蛋白等生物大分子相互作用，破壞其功能。MDA也可損害線粒體，其對(duì)線粒體的作用是呈劑量依賴性的。MDA可以通過(guò)抑制線粒體呼吸鏈和一些酶的活性引起線粒體功能紊亂[22]。本研究結(jié)果顯示，3組間MDA含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。F2-isoprostanes較MDA更容易從尿液排出[23]。因此，后者更能及早準(zhǔn)確地反應(yīng)體內(nèi)抗氧化能力的變化。

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