馮香安 李 垚 劉 瑩 金 芳 張 琳 呼林林 索艷麗

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所，哈爾濱 150030)

槲皮素是一種廣泛存在于自然界水果、蔬菜和谷物中的植源性黃酮類化合物，具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌消炎、保護肝腎和心血管及止腹瀉等作用[1]。在畜牧生產(chǎn)中，槲皮素可保護胚胎的雞精原細胞免于三乙基四硝基酚的氧化損傷，進而防止環(huán)境污染物對雞繁殖性能的損害[2]。此外，槲皮素對禽流感感染有一定的防治作用[3]，還可以顯著提高雞成骨細胞堿性磷酸酶(ALP)活性和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)磷酸化水平[4]，減少肉雞脂肪沉積[5]等。從以上功能來看，槲皮素可以作為一種飼料添加劑應(yīng)用于動物生產(chǎn)，對我國畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有一定意義。然而，槲皮素作為飼料添加劑的安全性一直未得到證實，本試驗擬通過急性毒性試驗、污染物致突變性檢測(Ames試驗)、小鼠骨髓細胞微核試驗和小鼠精子畸形試驗對槲皮素作為飼料添加劑的安全性作出評價。

1 材料與方法

1.1 受試物

槲皮素(C15H10O7·2H2O，純度為97%，阿拉丁公司)。

1.2 試驗動物

清潔級昆明種小鼠，由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供[許可證號:SCXK-(吉)2007-0003]。

1.3 菌株

Ames試驗采用鼠傷寒沙門菌突變型菌株TA97、TA98、TA100和 TA102，由黑龍江省疾病預(yù)防控制中心提供;肝微粒體多氯聯(lián)苯誘導(dǎo)劑(S9)由黑龍江省疾病預(yù)防控制中心提供。

1.4 試驗方法[6-7]

1.4.1 急性毒性試驗

采用限量法進行試驗，選用健康清潔級昆明種小鼠20只，體重18～20 g，雌雄各占1/2。試驗前隔夜禁食16 h，不禁水。取槲皮素5 g加0.5%羧甲基纖維素至20 mL混勻，按照20 mL/kg BW給予受試物混合物，間隔4 h 2次經(jīng)口灌胃，第2次灌胃后2 h復(fù)食。染毒劑量為10 g/kg BW，給藥后連續(xù)觀察14 d，記錄中毒表現(xiàn)和死亡情況。

1.4.2 Ames試驗

選用鼠傷寒沙門菌突變型菌株TA97、TA98、TA100和TA102作為測試菌株，設(shè)5個槲皮素劑量組以及陰性對照組和陽性對照組，槲皮素試驗劑量分別為 5 000、1 000、200、40、8 μg/皿。由于本試驗溶劑采用蒸餾水，所以不重復(fù)增設(shè)溶劑對照組，陰性對照組中蒸餾水劑量為0.1 mL/皿;陽性對照組試劑采用敵克松、疊氮鈉、2-乙酰氨基芴和1，8-二羥蒽醌，劑量分別為50.0、1.5、10.0和50.0 μg/皿，在加與不加S9混合液的情況下采用平板摻入法進行試驗，每個劑量重復(fù)3皿，每個試驗重復(fù)2次。記錄每皿回復(fù)突變菌落數(shù)。

1.4.3 小鼠骨髓細胞微核試驗

選用體重為25～30 g清潔級昆明種小鼠50只，雌雄各占1/2，隨機分為5組。設(shè)3個槲皮素劑量組，試驗劑量分別為5.0(高劑量組)、1.0(中劑量組)和0.2(低劑量組)g/kg BW，陰性對照組為0.5%羧甲基纖維素，陽性對照組為環(huán)磷酰胺，濃度為40 mg/kg BW，采用腹腔注射法。各組均按30 h給受試物法給藥。2次給受試物間隔24 h，第2次給受試物后6 h處死動物。取胸骨常規(guī)制片、鏡檢。每鼠計數(shù)1 000個骨髓嗜多染紅細胞(PCE)，并計算微核發(fā)生率，以千分率表示。每鼠計數(shù)200個 PCE，并計算 PCE與成熟紅細胞(RBC)比值(PCE/RBC)。

1.4.4 小鼠精子畸形試驗

選用體重25～35g雄性清潔級昆明種小鼠50只，隨機分為5組。設(shè)3個槲皮素劑量組，試驗劑量分別為5.0(高劑量組)、1.0(中劑量組)和0.2(低劑量組)g/kg BW，陰性對照組為0.5%羧甲基纖維素，陽性對照組為環(huán)磷酰胺，濃度為40 mg/kg BW。各組每日灌胃1次，連續(xù)5 d，在首次給予受試物35 d后處死，按常規(guī)方法制片，甲醇固定5 min，用2%蘇木精-伊紅(HE)溶液染色1 h，每只動物在顯微鏡下鏡檢1 000個完整精子，計算精子畸形率。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0進行統(tǒng)計分析，結(jié)果用平均值±標準差表示。急性毒性試驗結(jié)果采用單因素方差分析(one-way ANOVA);Ames試驗結(jié)果和小鼠骨髓細胞微核試驗結(jié)果均采用卡方檢驗方法分析;小鼠精子畸形試驗結(jié)果采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan氏法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性毒性試驗

由表1可見，經(jīng)過14 d觀察，本次試驗的20只小鼠在給藥后全部表現(xiàn)正常，飲水、采食及大小便均無較大變化，無一死亡;試驗結(jié)束時增重差異均不顯著(P＞0.05)。在試驗第14天將全部小鼠脫頸處死，剖檢，肉眼觀察其內(nèi)臟。心、肝、脾、肺、胃、腎、胸腺均未見任何異常變化。結(jié)果表明，槲皮素的半數(shù)致死劑量(LD50)＞10 g/kg BW，屬于實際無毒類物質(zhì)。

表1 急性毒性試驗Table1 Acute toxicity test

2.2 Ames試驗

由表2、表3、表4、表5可見，槲皮素各劑量組對Ames試驗各菌株在加與不加S9情況下，經(jīng)過2次試驗的回復(fù)突變菌落數(shù)均在正常范圍內(nèi)，并且沒有劑量反應(yīng)關(guān)系;各劑量組與陰性對照組的回復(fù)突變菌落數(shù)比較差異不顯著(P＞0.05)，與陽性對照組的回復(fù)突變菌落數(shù)比較差異極顯著(P＜0.01)，Ames試驗結(jié)果均呈陰性，即鼠傷寒沙門氏菌試驗為致突變陰性結(jié)果。

表2 槲皮素第1次Ames試驗(-S9)Table2 The first Ames test for quercetin(-S9)

表3 槲皮素第1次Ames試驗(+S9)Table3 The first Ames test for quercetin(+S9)

表4 槲皮素第2次Ames試驗(-S9)Table4 The second Ames test for quercetin(-S9)

表5 槲皮素第2次Ames試驗(+S9)Table5 The second Ames test for quercetin(+S9)

2.3 小鼠骨髓細胞微核試驗

由表6可見，雌、雄小鼠的PCE/RBC、微核數(shù)和微核率高、中、低劑量組與陰性對照組相比差異均不顯著(P＞0.05)，并且無劑量反應(yīng)關(guān)系;陽性對照組與其余各組相比差異極顯著(P＜0.01)，說明槲皮素的小鼠骨髓細胞微核試驗結(jié)果為陰性。此外，各劑量組的PCE/RBC差異均不顯著(P＞0.05)，說明各劑量組動物未見細胞毒性作用。

表6 小鼠骨髓細胞微核試驗Table6 Micronucleus test of mouse bone marrow cells

2.4 小鼠精子畸形試驗

由表7可見，各組小鼠均有一定數(shù)量的畸形精子出現(xiàn)，高、中、低劑量組與陰性對照組相比差異均不顯著(P＞0.05)，且沒有劑量反應(yīng)關(guān)系;高、中、低劑量組及陰性對照組與陽性對照組比較差異極顯著(P＜0.01)。結(jié)果表明，槲皮素對小鼠精子畸形發(fā)生率沒有影響，即槲皮素對小鼠精子畸形試驗的結(jié)果為陰性。

表7 小鼠精子畸形試驗Table7 Mouse sperm abnormality test

3 討論

急性毒性試驗是為了了解受試物的毒性強度和性質(zhì)，槲皮素對小鼠的LD50＞10 g/kg BW，小鼠未出現(xiàn)中毒表現(xiàn)、死亡和其他跡象。按照安全評價程序[6-7]，當 LD50＞10 g/kg BW 時屬實際無毒物質(zhì)，可不必求得確切的LD50值。在20世紀50年代有國外學(xué)者采用家兔來評價槲皮素的急性毒性，其結(jié)果也表明槲皮素為無毒物質(zhì)[8]。

Ames試驗、小鼠骨髓細胞微核試驗及小鼠精子畸形試驗均屬于致突變試驗，其目的是對槲皮素是否具有致突變作用的可能性進行篩選。Ames試驗是通過鼠傷寒沙門氏菌來檢測受試物是否具有誘變性的一種體外試驗方法;小鼠骨髓細胞微核試驗主要是對染色體結(jié)構(gòu)完整性的改變進行評估;小鼠精子畸形試驗是基于已知的生殖細胞對致突變物具有高度的敏感性，是檢測受試物對生殖細胞致突變作用的一種標準的體內(nèi)試驗方法。在本試驗中，槲皮素的Ames試驗、小鼠骨髓細胞微核試驗及小鼠精子畸形試驗結(jié)果均呈陰性，表明槲皮素不具有致突變作用。國內(nèi)外對植物黃酮類物質(zhì)的安全評價研究很多，本試驗與大多數(shù)植物黃酮類化合物的安全性評價結(jié)果一致[9]，如大豆異黃酮[10]、麻竹葉黃酮[11]、葡萄多酚[12]、蘋果多酚[13]、蛇麻素[14]等植物黃酮類物質(zhì)的致突變試驗結(jié)果均為陰性。而國外有研究表明，槲皮素具有致突變性，這與本試驗結(jié)果不符，但是對這一結(jié)果的安全評估系統(tǒng)尚未建立，所以這一結(jié)果是不確切的[15];又有 Helena 等[16]、Silva 等[17]、Utesch等[18]對槲皮素的致突變性做過研究，其結(jié)果均為陰性，與本試驗相一致。

由于槲皮素潛在的抗氧化功能和其他有益于健康的功能，其在各種食品中的應(yīng)用一直有增無減。但是，槲皮素在毒性方面又被證實了體外陽性誘變結(jié)果[19]。然而，很多動物試驗一直未能證明槲皮素的攝入與腫瘤患病率增加有任何關(guān)系。一些研究指出，槲皮素雖然在體外顯示有誘變活性，但是在體內(nèi)并沒有顯現(xiàn)致癌效果[1，20-23]。Okamoto[24]在研究中指出口服槲皮素是不會產(chǎn)生任何不利影響的。所以，結(jié)合本試驗結(jié)果，在適當劑量下口服槲皮素不會對動物產(chǎn)生毒性作用。

總之，本試驗采用急性毒性試驗、Ames試驗、小鼠骨髓細胞微核試驗及小鼠精子畸形試驗4種方法，兼顧了體內(nèi)與體外、體細胞和生殖細胞以及真核細胞和原核細胞的原則，較全面地評價了槲皮素的安全性，表明槲皮素是一種安全的飼料添加劑，可以廣泛地應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)中。

4 結(jié)論

①槲皮素的LD50＞10 g/kg BW，屬于實際無毒類物質(zhì)。

②槲皮素對鼠傷寒沙門氏菌各菌株無致突變性。

③槲皮素對小鼠骨髓細胞微核試驗結(jié)果為陰性，且未見細胞毒性。

④槲皮素對小鼠精子畸形發(fā)生率沒有影響。

[1]ERLUND I.Review of the flavonoids quercetin，hesperetin and naringenin.Dietary sources，bioactivities，and epidemiology[J].Nature Research，2004，24:851-874.

[2]MI Y，ZHHANG C，LI C M，et al.Quercetin protects embryonic chicken spermatogonial cells from oxidative damage intoxicated with 3-methyl-4-nitrophenol in primary culture[J].Toxicology Letters，2009，190:61-65.

[3]潘德敏，羅開健.槲皮素對禽流感病毒感染試驗雞的防治作用[J].廣東畜牧獸醫(yī)科技，2011，36(4):37-39.

[4]劉洪柱，李垚，陳鑫，等.沙棘總黃酮、槲皮素對雞成骨細胞堿性磷酸酶活性作用機制的體外研究[J].動物營養(yǎng)學(xué)報，2011，23(8):1378-1385.

[5]趙偉.槲皮素對肉雞肝細胞和脂肪細胞脂質(zhì)代謝的作用及機制[D].博士學(xué)位論文.哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[6]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB/T 15193—2003食品安全毒理學(xué)評價程序和方法[S].北京:中國標準出版社，2004.

[7]中華人民共和國衛(wèi)生部.保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范[S].北京:中國標準出版社，2003.

[8]AMBROSE A M，ROBBINS D J，DEEDS F.Comparative toxicities of quercetin and quercitrin[J].Journal of the American Pharmaceutical Association，1952，41:119-122.

[9]馮香安，劉紅南，劉瑩，等.植物黃酮作為飼料添加劑的安全性評價研究進展[J].中國飼料，2011(12):31-33.

[10]李立，王亞東，張焱，等.大豆異黃酮復(fù)合膠囊毒理學(xué)安全性評價[J].河南預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2010，21(1):38-41.

[11]唐浩國，魏曉霞，向進樂，等.麻竹葉黃酮的毒理學(xué)實驗[J].時珍國醫(yī)國藥，2007，18(10):2408-2410.

[12]沈繼紅，張愛軍.葡萄多酚的毒性實驗[J].毒理學(xué)雜志，2006，20(2):96-97.

[13]SHOJI T，AKAZOME Y，KANNDA T，et al.The toxicology and safety of apple polyphenol extract[J].Food and Chemical Toxicology，2004，42:959-967.

[14]NAGASAKO-AKAZOME Y，HONMA D，TAGASHIRA M，et al.Safety evaluation of polyphenols extracted from hop bracts[J].Food and Chemical Toxicology，2007，45:1383-1392.

[15]HARWOOD M，DANIELEWSKA-NIKIE B，BORZELLECA J F，et al.A critical review of the data related to the safety of quercetin and lack of evidence of in vivo toxicity，including lack of genotoxic/carcinogenic properties[J].Food and Chemical Toxicology，2007，45:2179-2205.

[16]CARIA H，CHAVECA T，LAIRES A，et al.Genotoxicity of quercetin in the micronucleus assay in mouse bone marrow erythrocytes，human lymphocytes，V79 cell line and identification of kinetochore-containing(CREST staining)micronuclei in human lymphocytes[J].Mutation Research，1995，343:85-94.

[17]SILVA J D，HERRMANN S M，HEUSER V，et al.E-valuation of the genotoxic effect of rutin and quercetin by comet assay and micronucleus test[J].Food and Chemical Toxicology，2002，40:941-947.

[18]UTESCH D，F(xiàn)EIGE K，DASENBROCK J，et al.Evaluation of the potential in vivo genotoxicity of quercetin[J].Mutation Research，2008，654:38-44.

[19]PAMUKCU A M，YALC I S，HATCHER J F，et al.Quercetin，a rat intestinal and bladder carcinogen present in bracken fern(Pteridium aquilinum)[J].Cancer Research，1980，40:3468-3472.

[20]DAS A，WANG J H，LIEN E J.Carcinogenicity，mutagenicity and cancer preventing activities offlavonoids:a structure-system-activity relationship(SSAR)analysis[J].Progress in Drug Research，1994，42:133-166.

[21]STAVRIC B.Quercetin in our diet:from potent mutagen to probable anticarcinogen[J].Clinical Biochemistry，1994，27:245-248.

[22]FORMICA J V，REGELSON W.Review of the biology of quercetin and related bioflavonoids[J].Food and Chemical Toxicology，1995，33:1061-1080.

[23]LAMSON D W，BRIGNALL M S.Antioxidants and cancer，part 3:quercetin[J].Alternative Medicine Review，2000，5:196-208.

[24]OKAMOTO T.Safety of quercetin for clinical application[J].International Journal of Molecular Medicine，2005，16:275-278.