易金娥 屠 迪 鄔 靜 袁 慧

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，長沙 410128)

隨著現(xiàn)代飼養(yǎng)業(yè)集約化程度的不斷提高，氧化應(yīng)激在畜禽生產(chǎn)中的危害已大量顯現(xiàn)，如何減少或緩解畜禽的氧化應(yīng)激已成為現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)的重大課題。一些具有抗氧化、清除自由基作用的植物源性免疫調(diào)節(jié)劑可望能有效地調(diào)控機體的氧化應(yīng)激進程，進而保障機體細胞內(nèi)外環(huán)境的平衡和生理機能健康。樺木酸(betulinic acid，BA)屬于羽扇豆烷型五環(huán)三萜類化合物，可從多種植物中分離得到，如樺木科、桃金娘科、鼠李科、五加科等，主要分布于樺木科樺木屬植物中，尤其以樺樹的外皮中最為豐富[1]。國外對BA的研究主要集中在抗腫瘤、抗艾滋病、抗菌以及其他藥理作用[2]方面，國內(nèi)對BA的研究主要集中在對腫瘤細胞凋亡的影響[3-4]方面，而其對正常細胞的作用未見系統(tǒng)研究。BA對正常細胞或機體具有保護作用，該保護作用可能與抗氧化應(yīng)激有一定的關(guān)系。BA能調(diào)控細胞周期調(diào)節(jié)蛋白，通過降低活性氧(ROS)的生成和核轉(zhuǎn)錄因子 -κB(NF-κB)的活性，抑制高糖誘導(dǎo)的人主動脈平滑肌細胞和人臍靜脈內(nèi)皮細胞的增殖，并對血管具有保護作用，能有效預(yù)防動脈粥樣硬化[5-6]。BA對甲醇致肝星狀細胞損傷具有保護作用，如抗氧化作用，抑制細胞因子的分泌，抑制轉(zhuǎn)化生長因子 - β(TGF-β)、NF-κB、c-jun氨基末端激酶(JNK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[7]。作者前期的研究發(fā)現(xiàn)，BA能激活小鼠腹腔巨噬細胞，提高其吞噬能力和能量代謝水平，增強機體抗氧化能力[8];進一步的研究發(fā)現(xiàn)，BA具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用，對小鼠的細胞免疫、體液免疫和非特異免疫功能有明顯的增強作用[9-10]。BA藥理作用的發(fā)揮可能與提高機體的免疫能力和抗氧化應(yīng)激有關(guān)，不一定直接作用于感染或腫瘤細胞。因此，本試驗擬采用體內(nèi)給藥途徑，系統(tǒng)研究BA對小鼠免疫器官抗氧化能力的影響，為BA的抗氧化應(yīng)激研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用BA是以白樺樹皮(2009年春季收集于波蘭弗羅茲瓦夫市，經(jīng)60℃烘干后貯藏在黑暗、干燥處備用)為原料，按參考文獻[11]的方法在波蘭弗羅茲瓦夫環(huán)境與生命科學(xué)大學(xué)自制獲得。具體方法如下:稱取白樺樹皮粉末15 g，用200 mL甲醇70℃加熱回流3 h，減壓干燥并用二氯甲烷溶解，再加2 mol/L氫氧化鈉(NaOH)200 mL攪拌分層，收集下層液，減壓蒸干并用適量乙醚溶解，加適量的水充分搖勻，收集上層液，減壓干燥得樺木醇粗品3.452 g。取樺木醇粗品，硅膠柱層析后減壓干燥得樺木醇純品。樺木醇純品用適量丙酮溶解并快速攪拌冷卻至5～10℃后，逐滴加入新制的瓊斯試劑，使樺木醇與瓊斯試劑的摩爾比為1∶6，20℃反應(yīng)3 h，過濾除去墨綠色沉淀，減壓蒸干丙酮，殘液用乙酸乙酯萃取，水洗，10%碳酸氫鈉(NaHCO3)洗滌，有機相用無水硫酸鎂(MgSO4)干燥，所得淡黃色固體即為樺木酮酸粗品。樺木酮酸粗品用乙醚溶解，快速柱色譜分離，減壓干燥，得樺木酮酸純品。取樺木酮酸純品用硼氫化鈉/四氫呋喃(NaBH4/THF)還原，將所得固體溶于20 mL甲醇并煮沸15～20 min，冷卻重結(jié)晶得BA。

1.2 試驗動物與飼糧

選用體重18～22 g、5～6周齡的雄性昆明(KM)小鼠為試驗動物。試驗飼糧為小鼠專用飼料，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，其主要營養(yǎng)水平如下:粗蛋白質(zhì)(CP)20.50%、粗脂肪(EE)4.62%、鈣(Ca)1.23%、磷(P)0.91%、賴氨酸(Lys)1.30%、蛋氨酸+胱氨酸(Met+Cys)0.68%。

1.3 試驗設(shè)計

將28只KM小鼠于溫度為21～25℃、相對濕度為60%的飼養(yǎng)房中飼養(yǎng)1周后，隨機分為4組，每組7只。1組為對照組，每天每只通過灌胃給予1%可溶性淀粉溶液0.2 mL;2、3、4組為試驗組，每天每只通過灌胃給予含不同劑量BA的1%可溶性淀粉溶液(分別按每千克體重0.25、0.50、1.00 mg的劑量將BA混懸于1%可溶性淀粉溶液中)0.2 mL。通過預(yù)試驗確定試驗期為14 d。

1.4 樣品采集

試驗結(jié)束后，各組小鼠禁食(自由飲水)12 h，頸椎脫臼處死，解剖后取出脾臟和胸腺。將脾臟和胸腺用預(yù)冷生理鹽水漂洗，濾紙吸干水分后稱重，按組織與預(yù)冷生理鹽水1∶10的質(zhì)量體積比制成10%組織勻漿，3 000 r/min離心15 min，收集上清液待測。

1.5 測定指標與方法

測定脾臟和胸腺中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性，丙二醛(MDA)含量以及總抗氧化能力(T-AOC)。其中，SOD活性采用黃嘌呤氧化酶法測定;GSH-Px活性采用二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)法測定;MDA含量采用硫代巴比妥酸顯色法測定;T-AOC采用FRAP(化學(xué)比色法)法測定。采用考馬斯亮藍法測定脾臟和胸腺中總蛋白含量?？偟鞍住DA、SOD、GSH-Px與T-AOC測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.6 數(shù)據(jù)分析和處理

采用SPSS 16.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果以平均值±標準差表示。采用t檢驗分析組間差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 BA對小鼠免疫器官中SOD活性的影響

由表1可知，各試驗組脾臟和胸腺中SOD活性較對照組均有所升高，并隨BA劑量的增加而升高，呈量效遞增關(guān)系。與對照組相比，4組脾臟中SOD活性顯著升高(P＜0.05)，同時胸腺中SOD活性極顯著升高(P＜0.01)。

2.2 BA對小鼠免疫器官中GSH-Px活性的影響

由表2可知，各試驗組脾臟和胸腺中GSH-Px活性較對照組均有所升高，但不呈量效遞增關(guān)系。與對照組相比，3和4組脾臟中GSH-Px活性均顯著升高(P＜0.05);3組胸腺中GSH-Px活性顯著升高(P＜0.05)。

2.3 BA對小鼠免疫器官中MDA含量的影響

由表3可知，各試驗組脾臟和胸腺中MDA含量較對照組均有所降低，并隨BA劑量的增加而降低，呈量效遞減關(guān)系。與對照組相比，3組脾臟中MDA含量顯著降低(P＜0.05)，4組脾臟中MDA含量極顯著降低(P＜0.01);2、3和4組胸腺中MDA含量均極顯著降低(P＜0.01)。

表1 BA對小鼠脾臟和胸腺中SOD活性的影響Table1 Effects of BA on SOD activity of spleen and thymus in mice(n=7) U/mg prot

表2 BA對小鼠脾臟和胸腺中GSH-Px活性的影響Table2 Effects of BA on GSH-Px activity of spleen and thymus in mice(n=7) U/mg prot

表3 BA對小鼠脾臟和胸腺中MDA含量的影響Table3 Effects of BA on MDA content of spleen and thymus in mice(n=7) nmol/mL

2.4 BA對小鼠免疫器官中T-AOC的影響

由表4可知，各試驗組脾臟和胸腺中T-AOC較對照組均有所升高，并隨BA劑量的增加而升高，呈量效遞增關(guān)系。與對照組相比，3組脾臟中T-AOC顯著升高(P＜0.05)，4組脾臟中T-AOC極顯著升高(P＜0.01)，3和4組胸腺中T-AOC均極顯著升高(P＜0.01)。

表4 BA對小鼠脾臟和胸腺中T-AOC的影響Table4 Effects of BA on T-AOC of spleen and thymus in mice(n=7) U/mg prot

3 討論

SOD和GSH-Px是機體內(nèi)廣泛存在的、重要的催化過氧化氫(H2O2)分解的酶[8]。SOD是機體代謝的關(guān)鍵酶，可調(diào)節(jié)機體的氧化與抗氧化的平衡，其活性的高低反映了機體清除氧自由基能力的強弱，在機體抗氧化損傷、抗衰老與免疫調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著重要作用[8，12]。GSH-Px 是 H2O2防御系統(tǒng)成員，可以清除活細胞內(nèi)過氧化物，在保護細胞免受自由基損傷的過程中起著關(guān)鍵作用[12]。據(jù)報道，BA能顯著降低由甲醇或鎘誘導(dǎo)的人中性白細胞中超氧陰離子數(shù)量[13]，刺激巨噬細胞吞噬能力增強，提高巨噬細胞中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平以及 SOD、GSH-Px 活性[8]，增強淋巴細胞活性和改變T、B淋巴細胞數(shù)目或亞群，增加綿羊紅細胞(SRBC)免疫小鼠溶血空斑數(shù)[9]，混合調(diào)控Th1/Th2類細胞因子[10]，說明BA具有細胞免疫、體液免疫和非特異性免疫的功能。本試驗顯示，BA可提高小鼠脾臟和胸腺中SOD和GSH-Px活性，表明BA可通過增強SOD和GSHPx活性來保護小鼠免疫器官免受自由基的損傷，從而提高免疫器官的抗氧化能力。

MDA是不飽和脂肪酸過氧化產(chǎn)物之一，其產(chǎn)量的高低可反映過氧化程度的強弱。生物膜中的不飽和脂肪酸易被自由基攻擊而發(fā)生過氧化，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化，這些變化勢必影響細胞基本的生命活動，最終導(dǎo)致淋巴細胞功能低下[12]。本試驗中，BA可降低小鼠胸腺和脾臟中MDA含量，表明BA可以通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)過氧化程度而影響小鼠免疫器官的抗氧化能力。

T-AOC代表體內(nèi)酶類和非酶類抗氧化物質(zhì)的總和，是反映機體抗氧化能力的重要指標，其強弱與健康狀況和疾病狀態(tài)之間存在著密切的聯(lián)系，當(dāng)其降低時，會引起炎性反應(yīng)、腫瘤和免疫系統(tǒng)疾病等[14]。本試驗發(fā)現(xiàn)，BA能提高小鼠脾臟和胸腺中T-AOC，并隨BA劑量的增加而升高，呈量效遞增關(guān)系。這說明BA可增加小鼠免疫器官中酶類或非酶類抗氧化物質(zhì)的合成，進而增強免疫器官的抗氧化能力。

4 結(jié)論

BA可提高小鼠脾臟和胸腺中SOD、GSH-Px活性以及T-AOC，降低脾臟和胸腺中MDA含量，進而增強免疫器官的抗氧化能力。

[1]PISHA E，CHAI H，LEE I S，et al.Discovery of betulinic acid as a selective inhibitor of human melanoma that functions by induction of apoptosis[J].Nature Medicine，1995，1(10):1046-1051.

[2]ROBERT H C，SAMIR A K.Chemistry，biological activity，and chemotherapeutic potential of betulinic acid for the prevention and treatment of cancer and HIV infection[J].Medicinal Research Reviews，2004，24(1):90-114.

[3]葉銀英，何道偉，葉文才，等.2，3-二羥基樺木酸體外和體內(nèi)抗黑色素瘤作用的研究[J].中國腫瘤臨床與康復(fù)，2001，22(4):163-166.

[4]李清，王曉宇，李楊，等.人參皂甙Rh2提高人源肝癌細胞HepG2對樺木酸敏感性的作用機制[J].中國生物制品學(xué)雜志，2011，24(5):531-533.

[5]YOON J J，LEE Y J，KIM J S，et al.Betulinic acid inhibits high glucose-induced vascular smooth muscle cells proliferation and migration[J].Journal of Cellular Biochemistry，2010，111(6):1501-1511.

[6]YOON J J，LEE Y J，KIM J S，et al.Protective role of betulinic acid on TNF-alpha-induced cell adhesion molecules in vascular endothelial cells[J].Biochemical and Biophysical Research Communications，2010，391(1):96-101.

[7]SZUSTER-CIESIELSKA A，PLEWKA K，DANILUK J，et al.Betulin and betulinic acid attenuate ethanol-induced liver stellate cell activation by inhibiting reactive oxygen species(ROS)，cytokine(TNF-α，TGF-β)production and by influencing intracellular signaling[J].Toxicology，2011，280(3):152-163.

[8]易金娥，OBMINSKA-MRUKOWICZ B，杜金艷，等.樺木酸對巨噬細胞免疫功能和抗氧化作用的研究[J].營養(yǎng)學(xué)報，2010，32(3):281-285.

[9]YI J E，OBMINSKA-MRUKOWICZ B，YUAN L Y，et al.Immunomodulatory effects of betulinic acid from the bark of white birch on mice[J].Journal of Veterinary Science，2010，11(4):305-313.

[10]易金娥，袁莉蕓，文利新，等.樺木酸對小鼠淋巴細胞及巨噬細胞的影響分析[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2011，42(1):124-130.

[11]易金娥，文利新，袁莉蕓，等.白樺樹中樺木醇的提取與樺木酸合成研究[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2010，36(5):574-580.

[12]帥學(xué)宏，胡庭俊，陳炅然，等.鬼臼多糖對小鼠免疫功能和抗氧化能力的影響[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2008，39(7):1000-1004.

[13]AGNIESZKASC，MARTYNA K S.Protective effects of betulin and betulinic acid against ethanol-induced cytotoxicity in HepG2 cells[J].Pharmacological Reports，2005，57(5):588-595.

[14]俸家富，趙平武，王東.血液中總抗氧化態(tài)與疾病的關(guān)系[J].國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2009，30(6):571-573.