張育垚，李景富，謝立波，張 賀，康立功，姜景彬，許向陽

（東北農業(yè)大學園藝學院，哈爾濱 150030）

番茄葉霉病是危害保護地番茄生產的重要病害之一，是一種世界性的病害，可導致番茄產量下降，直接影響番茄生產的經濟效益。英國于1883年首次報道了番茄葉霉病的發(fā)生[1]，自此以后，世界各國科學家展開了對番茄葉霉病的研究。隨著番茄保護地種植面積的不斷擴大，保護地內特殊的環(huán)境條件造成的番茄葉霉病病害也日趨嚴重，因而，番茄葉霉病受到植病專家和育種專家的廣泛關注。

防治番茄葉霉病最有效的方法就是培育抗病品種。美國、加拿大從20世紀30年代開始進行抗病品種的選育，日本從60年代開始相關研究，70年代就已育成近60個抗葉霉病品種。而我國的番茄抗葉霉病育種開始于上世紀80年代。上個世紀70、80年代已經在荷蘭、法國等地發(fā)現(xiàn)了侵染Cf-5和Cf-9基因的番茄菌株[2-3]，但是盡管如此，國外新育成的抗病品種仍然以Cf-5和Cf-9基因為主。我國主要育種單位先后培育出如中雜9號、佳粉15號和浙粉202等一系列抗病品種[4]，其中佳粉15號一代雜種，含有兩個抗葉霉病基因（Cf-4、Cf-5）。利用具較高抗性的Cf-5基因也將是我國葉霉病抗病育種的重要目標之一。

依靠常規(guī)的方法培育抗病品種困難很大，這是由于人為的鑒定標準存在差異，在一定程度上造成了鑒定結果的不準確性，同時在鑒定過程中要耗費大量的人力和物力，延長了育種周期，經過較長時間培育的抗病品種很可能在推廣時就己經成為非抗病品種。因此，利用分子標記輔助選擇育種成為了有效控制番茄葉霉病的一條新途徑。

單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphisms，SNP）是指同一物種不同亞種、變種以及不同個體間由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性，目前它已作為新一代分子標記，在分子遺傳學研究中發(fā)揮著重要作用。在植物分子生物學研究中，SNPs標記已受到各國學者的高度重視，現(xiàn)已在水稻[5-6]、小麥[7]的亞種間以及向日葵[8]、玉米[9]、木薯[10]等糧食和經濟作物中開展了SNP研究。利用SNP對番茄進行輔助育種為有效控制番茄葉霉病提供了一條新途徑。本研究以4份抗病材料和4份感病材料為試材，以Cf-5基因為研究對象，開發(fā)Cf-5基因的SNP標記，為番茄葉霉病抗病基因Cf-5的分子標記輔助育種奠定良好的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的番茄材料均由東北農業(yè)大學園藝學院番茄課題組提供。

番茄葉霉病抗病品種編號：06831、06832、06885、09876；

番茄葉霉病感病品種編號：06905、06907、06914、06919。

1.2 方法

1.2.1 番茄葉霉病抗性苗期接種鑒定

取保存的番茄葉霉病菌1.2.3.4，用蒸餾水洗成孢子懸浮液，孢子濃度為每毫升1×107個孢子，接種前24 h對接種植株進行保濕，次日傍晚對待檢測番茄材料進行噴霧接種。18 d后開始根據(jù)葉片病斑情況進行調查。

1.2.2 DNA的提取

當番茄植株長至2～3葉期時，進行葉片的采摘，采摘后用自來水及蒸餾水清洗兩遍，保證提取的DNA有較高的質量。將試驗材料各單株的葉片分裝到1.5 mL離心管中，每管約為0.1 g，寫清編號，用液氮速凍后備用。采用CTAB法對番茄材料進行DNA的提取[11]。

用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA是否降解，用紫外分光光度計測定DNA在OD260和OD280下的吸光值，所有材料OD260/OD280均在1.7～1.9之間，表明DNA質量很好。

1.2.3 引物設計

綜合Primer primer 5和Oligo6軟件，以Cf-5基因為模板設計3對嵌套引物，采用高保真的Pfu DNA聚合酶（美國MBI公司）進行PCR，擴增抗感番茄材料的Cf-5基因序列。引物如表1所示。

表1 引物序列及信息Table1 Sequence and information of the primers

1.2.4 PCR擴增

PCR反應體系（50 μL）：35.5 μL ddH2O，5 μL 10×Pfu Buffer，5 μL dNTP，1 μL上游引物，1 μL下游引物，2μL模板DNA，0.5μLPfuDNA聚合酶。

熱循環(huán)程序：95℃預變性3 min，（95℃變性30 s、Tm-5℃退火30 s、72℃延伸2 min）×35個循環(huán)，72℃終延伸10 min，4℃保存。

1.2.5 測序及序列比對，查找SNP位點

測序由北京六合華大基因科技股份有限公司和上海生工生物工程技術服務有限公司共同完成。用DNAStar軟件系統(tǒng)的Editseq、Seqman、MegAlign軟件包分析已測序列，獲得基因序列特異的差異。

1.2.6 SNP檢測

針對SNP位點，設計特異引物。本試驗針對580 bp T-C轉換和2 879 bp處的G-T顛換篩選出6個引物，其中，T-C轉換中，T1為T13、T14的互補引物；G-T顛換中，T2為T18、T19的互補引物。以抗感番茄材料DNA為模板進行AS-PCR擴增，ASPCR反應體系（20 μL）：10×Buffer 2 μL，上下游引物各1 μL，Mg2+2 μL，dNTP 1 μL，DNA模板1 μL，Taq酶0.2 μL。反應程序為：94℃預變性5 min，（94℃變性45 s、Tm-5℃退火45 s、72℃延伸1 min）×35個循環(huán)，72℃終延伸10 min，4℃保存。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增結果

以8個含有Cf-5基因的番茄抗感材料總基因組DNA為模板，用本研究設計并合成的三對嵌套引物進行PCR擴增，可以擴增出片段長度分別為1 936、1 542和769 bp。

由圖1可以看出，在所有8份材料中均擴增出了與目的基因序列長度相符的基因片段，表明引物設計及擴增程序是可行的，所擴增的片段應該是Cf-5基因或其等位基因的單拷貝片段。

圖1 PCR擴增產物的電泳檢測Fig.1 Detection of PCR product

2.2 生物學信息比對結果

試驗通過對NCBI上公布的Cf-5基因序列以及抗病材料06885、06831、06832、09876，感病材料06905、06907、06914、06919的擴增產物進行了多態(tài)性分析。得到兩個SNP突變（S580-T→C，S2879-G→T），如圖2所示。

圖2 樣本的突變位點Fig.2 Mutation sites of the samples

2.3 等位基因PCR引物設計與篩選

為了獲得理想的特異條帶，我們在試驗中分別在引物3'端的第2、3個堿基位置引入錯配堿基，并檢測它們的擴增情況。試驗中以06885和06919為材料進行引物的篩選，通過篩選，確定T1、T2、T13、T14、T18、T19為等位基因特異引物。引物T1、T13、T14為針對580 bp處SNP位點設計的互補引物，其中T1為正義鏈通用引物，T13為3'端與SNP突變基因型相匹配的反義鏈引物，T14的3'端則與SNP位點基因型不匹配，同時，在T13、T14的3'端第二位均引入A/G堿基錯配；引物T2、T18、T19為針對2 879 bp處SNP位點設計的互補引物，其中T2為正義鏈通用引物，T18為3'端與SNP突變基因型相匹配的反義鏈引物，T19的3'端則與SNP位點基因型不匹配，同時，在T18、T19的3'端第二位也均引入A/G強錯配堿基，結果顯示，T13、T18僅在06919中有特異條帶，在06885中無條帶，T14、T19僅在06885中有特異條帶，而在06919中無條帶（見圖3）。由此可以判斷，T1、T2、T13、T14、T18、T19引物特異性良好，為種質資源抗葉霉病篩選奠定了良好的基礎。

圖3 與SNP位點匹配的等位基因特異引物擴增Fig.3 Allele-specific primer amplification on the SNP site

2.4 SNP分子標記的獲得

通過將NCBI上公布的番茄抗葉霉病基因Cf-5基因與抗病材料和感病材料中Cf-5基因進行序列比對，以及以06885和06919為親本的F2群體對兩對引物的相互篩選驗證，我們得到了穩(wěn)定的等位基因特異引物T14和T19，它們在抗病材料06885和感病材料06919之間獲得了穩(wěn)定的差異（見圖3），并且在F2群體的分型的帶型檢測中獲得了穩(wěn)定的遺傳多樣性。

3 討論與結論

試驗中應用前人總結出的等位基因設計原理針對以上突變位點設計大量的等位基因特異PCR引物，以期獲得理想的PCR效果。通常認為，引物3'末端堿基與模板互補才會在適合的條件下發(fā)生延伸，否則不能延伸。但是，在實際應用中，3'末端單個堿基的錯配通常不能阻止擴增延伸，因此，Ye等的研究認為[12]，在特異引物3'端1、2位加入錯配堿基就可以獲得較好的差異產物，且C/T與G/A錯配為強的堿基錯配類型；A/A、C/C、G/G、T/T為中等的堿基錯配類型；C/A和G/T為弱的堿基錯配類型。因此，在特異引物3'末端錯配堿基的搭配上采取強弱搭配，或者中中搭配，獲得理想擴增效果的可能性較大。

目前，分子標記輔助選擇已成為農作物分子育種的關鍵技術，國內番茄抗病育種在基因工程方面主要應用的技術有RAPD、AFLP、微衛(wèi)星技術等第一代、第二代分子標記[13-15]，SNPs作為繼第一代、第二代分子標記后的第三代分子標記，具有密度高，多態(tài)性豐富，高度遺傳穩(wěn)定性等優(yōu)點，同時，SNP是一種二態(tài)的標記，易于分型，有利于快速的，自動化的篩選和檢測以及批量規(guī)模的篩選和分析[16]，因此，SNP標記具有新一代分子標記所特有的意義和價值，在分子標記輔助選擇育種中具有廣闊的應用前景。

本研究的等位基因特異引物設計，結合前人的研究成果，首選第2、3位引入強錯配堿基以及低2、3位中強錯配堿基搭配的方法，獲得較好的差異擴增，節(jié)約了試驗成本。

番茄抗葉霉病基因Cf-5基因的相關研究早有報道。van Wordrege等利用攜帶L.pennllii染色體6的置換體系“WSL6”（Substitution line），并結合缺失作圖對分離世代進行了分子標記作圖分析，發(fā)現(xiàn)Cf-2/Cf-5座位和Mi基因與SCAR標記REX-1緊密連鎖[17]。1993年，Cf-5基因的成功克隆為本研究的SNP標記的開發(fā)奠定了基礎[17]。本研究利用已知的Cf-5基因序列創(chuàng)制分子標記，所開發(fā)的SNP標記具有一定的穩(wěn)定性與可靠性，這將為番茄抗葉霉病基因Cf-5基因的分子標記輔助育種提供有效的選擇手段。

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