王志平

(1渭南師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，陜西渭南714000;2陜西省多河流濕地生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西渭南714000)

聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)是一項(xiàng)DNA體外擴(kuò)增技術(shù)，主要應(yīng)用于特異性基因的檢測(cè)以及生物鑒定等方面.1983年P(guān)CR技術(shù)發(fā)明以來，生物技術(shù)迅猛發(fā)展.早期的PCR定量方法都是基于產(chǎn)物的終點(diǎn)濃度測(cè)定，20世紀(jì)90年代實(shí)時(shí)(real-time)PCR的發(fā)明推動(dòng)了PCR定量技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用［1－2］.熒光定量PCR是在普通PCR技術(shù)基礎(chǔ)上建立的一種核酸定量技術(shù)，即在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)的積累對(duì)整個(gè)PCR進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量.目前，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于疾病診斷、食品檢測(cè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)以及分子生物學(xué)研究等領(lǐng)域，而且其應(yīng)用范圍仍在不斷拓展.

1 熒光定量PCR技術(shù)原理

在熒光定量PCR反應(yīng)體系中加入一種熒光化學(xué)物質(zhì)，目前，最常用的是SYBR GreenⅠ染料，它能與雙鏈DNA小溝部位結(jié)合，而且具有綠色激發(fā)波長(zhǎng).在PCR進(jìn)程的復(fù)制和延伸階段，該染料插入DNA雙鏈中發(fā)出熒光，在變性階段，由于DNA雙鏈解開，染料從DNA分子上游離下來而不產(chǎn)生熒光，因此熒光信號(hào)的強(qiáng)弱與雙鏈DNA的量成正比.PCR進(jìn)程中，隨著產(chǎn)物的積累，熒光信號(hào)的強(qiáng)度等比加強(qiáng).每經(jīng)過一次循環(huán)，收集一次熒光信號(hào)，即可得到一個(gè)熒光擴(kuò)增曲線(圖1)，根據(jù)熒光強(qiáng)度的變化即可監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化.

通常，熒光擴(kuò)增曲線可分為三個(gè)階段，即熒光背景信號(hào)階段、熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期.在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段，PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，因此可以在該階段進(jìn)行定量分析.為了便于對(duì)所檢測(cè)樣本進(jìn)行比較，在指數(shù)期需要設(shè)定一個(gè)熒光信號(hào)的閾值.檢測(cè)到的熒光信號(hào)超過閾值則被認(rèn)為是真正的信號(hào).熒光信號(hào)由本底進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段的閾值所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù)稱為Ct值.模板的Ct值與其起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，則Ct值越小(圖2).利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品及其相應(yīng)的Ct值可繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)得未知樣品的Ct值后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線便可準(zhǔn)確計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù).

2 熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用

定量PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，有效解決了PCR污染和定量不準(zhǔn)確等問題.首先，該技術(shù)特異性強(qiáng)、靈敏度高，可以對(duì)小于5拷貝的靶基因序列進(jìn)行定量分析，也可以對(duì)表達(dá)差異極其微小的基因進(jìn)行比較分析;其次，該技術(shù)定量準(zhǔn)確，整個(gè)過程在全封閉的容器中進(jìn)行反應(yīng)，不需要對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行染色以及電泳檢測(cè)等后續(xù)操作，極大地降低了交叉污染的可能性;另外，該技術(shù)簡(jiǎn)便快速高效，便于高通量自動(dòng)分析［3］，已成為科學(xué)研究與生產(chǎn)實(shí)踐的重要工具之一.

圖2 模板量與Ct值的關(guān)系

2.1 在疾病診斷與治療中的應(yīng)用

在疾病診斷中，樣品內(nèi)病原體達(dá)到一定數(shù)量才具有臨床意義，因此必須對(duì)樣品中的病原體進(jìn)行定量才能作為診斷依據(jù)，并為藥物治療以及后續(xù)觀察提供參考.傳統(tǒng)PCR技術(shù)及凝膠電泳在病原體的定性檢測(cè)中具有較高靈敏度，然而卻不能實(shí)現(xiàn)病原體的準(zhǔn)確定量.相比之下，定量PCR技術(shù)在疾病診斷與治療的應(yīng)用卻逐步得到了推廣.目前，熒光定量PCR技術(shù)已成功應(yīng)用于人類乳頭瘤病毒、肝炎病毒和人類免疫缺陷病毒等，以及結(jié)核桿菌、支原體、衣原體等多中病原體的檢測(cè)研究［4］.例如，Kessler等發(fā)現(xiàn)利用定量PCR技術(shù)可以對(duì)乙型肝炎病毒感染的不同程度進(jìn)行鑒定，從而為后續(xù)治療提供參考依據(jù)［5］.

癌基因在致癌因子作用下表達(dá)增加或突變通常是在腫瘤發(fā)生早期和良性階段，導(dǎo)致腫瘤很難被及時(shí)診斷與治療.熒光定量PCR技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用則能夠有效解決這一技術(shù)難題，它不但能夠有效檢測(cè)癌基因的突變，而且能夠?qū)Π┗虻谋磉_(dá)水平進(jìn)行準(zhǔn)確定量，從而用于腫瘤的早期診斷、分型、分期以及預(yù)后判斷.例如，F(xiàn)errari等發(fā)現(xiàn)可以將癌基因在盆腔淋巴結(jié)中的表達(dá)情況作為前列腺癌治療的預(yù)后標(biāo)志，對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移情況進(jìn)行分析［6］.另外，利用該技術(shù)可觀測(cè)用藥前后及復(fù)發(fā)時(shí)腫瘤細(xì)胞中耐藥基因的表達(dá)變化，為研究腫瘤耐藥、指導(dǎo)臨床治療提供有效途徑［7］.

熒光定量PCR技術(shù)在獸醫(yī)研究中也得到越來越廣泛的應(yīng)用.例如，關(guān)于貓冠狀病毒和萊姆病等多種病原體的熒光定量PCR檢測(cè)方法均已建立.有研究表明，用定量PCR能夠快速靈敏地檢測(cè)雞傳染性支氣管炎病毒［8］，牛偉等建立了定量檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬瘟病毒的熒光定量PCR方法［9］，從而為相關(guān)疾病的診斷與治療提供有效依據(jù).

在新藥開發(fā)的研究過程中，熒光定量PCR技術(shù)可以快速了解藥物對(duì)疾病進(jìn)程的影響，為新藥開發(fā)節(jié)約大量的人力、時(shí)間和資金.

2.2 在食品檢測(cè)方面的應(yīng)用

目前，熒光定量PCR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于食源微生物、食品過敏源、轉(zhuǎn)基因食品以及動(dòng)物源性食品的檢測(cè)等方面.邵彪等發(fā)現(xiàn)利用多重?zé)晒舛縋CR可以在同一反應(yīng)體系下同時(shí)對(duì)食品中多種污染菌進(jìn)行準(zhǔn)確快速的檢測(cè)［10］.在食品發(fā)酵過程中，利用熒光定量PCR技術(shù)可以直接檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物中的微生物種群，而不需要培養(yǎng)活菌，因此可以縮短檢測(cè)程序，提高檢測(cè)效率.

在轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)方面，裘劼人等驗(yàn)證了利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物中外源基因拷貝數(shù)的可行性［11］.Muleg等利用該技術(shù)檢測(cè)葡萄中曲霉菌的污染程度［12］.日本和美國(guó)等13個(gè)實(shí)驗(yàn)室運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米和轉(zhuǎn)基因大豆進(jìn)行了定量研究，結(jié)果表明，熒光定量PCR技術(shù)可以應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因作物標(biāo)識(shí)制度的實(shí)際檢測(cè)［13］.

2.3 在環(huán)境監(jiān)測(cè)方面的應(yīng)用

環(huán)境中存在許多致病微生物，它們與疾病傳播密切相關(guān).因此，定期檢測(cè)環(huán)境中致病微生物的種類、數(shù)量及其變化趨勢(shì)對(duì)于傳染病的預(yù)防和控制具有重要意義.與傳統(tǒng)的環(huán)境微生物病原體檢測(cè)方法相比，熒光定量PCR技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn).Brooks等的研究表明，定量PCR技術(shù)對(duì)甲肝病毒的定性及定量測(cè)定均有很高的精確度［14］.Rebecca等建立了利用定量PCR技術(shù)對(duì)易引起水傳播疾病的賈第蟲和隱孢子蟲進(jìn)行定量分析的方法［15］.李偉等建立了應(yīng)用熒光PCR技術(shù)定量檢測(cè)土壤和臟器中炭疽芽孢桿菌的方法［16］.Grtintzig等利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)環(huán)境樣品中功能基因(反硝化亞硝酸鹽還原酶基因)的豐度，進(jìn)而分析不同環(huán)境中施氏假單胞菌的豐度［17］.何閃英和吳小剛建立了定量檢測(cè)赤潮生物圓海鏈藻的實(shí)時(shí)定量PCR方法，為赤潮研究提供了有效的檢測(cè)技術(shù)［18］.

此外，利用熒光定量PCR技術(shù)還可以定量研究微生物的種類組成及數(shù)量變化，進(jìn)而深入探索微生物群落與環(huán)境因子之間的相互作用及其動(dòng)態(tài)變化過程，為預(yù)測(cè)不同環(huán)境條件下微生物種類組成與數(shù)量變化趨勢(shì)提供依據(jù)，進(jìn)而為傳染病的預(yù)防和控制提供參考.例如，Tay和Hemond利用定量PCR技術(shù)檢測(cè)了兩種甲苯降解菌自養(yǎng)黃色桿菌和分支桿菌在污染區(qū)和非污染區(qū)的數(shù)量分布情況以及兩種微生物數(shù)量的季節(jié)性變動(dòng)［19］.

2.4 在遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用

在遺傳學(xué)研究中，利用熒光定量PCR技術(shù)可以進(jìn)行點(diǎn)突變分析、突變基因檢測(cè)、等位基因分析、DNA甲基化檢測(cè)以及單核苷酸多態(tài)性分析等方面的研究.例如，利用熒光定量PCR并結(jié)合相關(guān)測(cè)序方法，可以對(duì)已知DNA序列的突變基因和序列多態(tài)性進(jìn)行定位，也可通過擴(kuò)增DNA限制性位點(diǎn)的方法來檢測(cè)遺傳變異.Bjerre等利用定量PCR技術(shù)進(jìn)行了單核苷酸多態(tài)性和基因突變方面的研究［20］.若在擴(kuò)增之前對(duì)DNA進(jìn)行處理，然后用特異的引物和探針可以區(qū)分甲基化和非甲基化的DNA，從而研究不同處理對(duì)DNA結(jié)構(gòu)的影響.另有研究表明，利用熒光定量PCR技術(shù)還可以有效鑒定雜合子和純合子［21］.

在分子生物學(xué)研究中，熒光定量PCR技術(shù)主要用于基因表達(dá)研究.應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)可對(duì)mRNA表達(dá)水平和動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行研究，例如mRNA的直接定量分析、突變等位基因檢測(cè)、mRNA剪接變異體的檢測(cè)等，其中，在定量mRNA表達(dá)水平的研究中應(yīng)用最為普遍.此外，該方法還用于細(xì)胞凋亡的研究.例如，路釗等運(yùn)用該技術(shù)研究了BATF2/SARI轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制［22］.

2.5 在法醫(yī)鑒定中的應(yīng)用

目前，熒光定量PCR技術(shù)在法醫(yī)上主要應(yīng)用于親子鑒定和個(gè)人識(shí)別，從血痕、精斑、毛發(fā)、骨或其他組織中提取DNA后，通過DNA分型或DNA指紋可以進(jìn)行親子鑒定或個(gè)人識(shí)別，從而為案例偵破提供有效的法律依據(jù).

3 結(jié)語

熒光定量PCR技術(shù)是近年發(fā)展起來的一種新的DNA定量檢測(cè)方法，可以彌補(bǔ)普通PCR的許多不足，在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)、食品檢驗(yàn)、環(huán)境監(jiān)測(cè)及生物學(xué)研究等領(lǐng)域的應(yīng)用逐步得到推廣.隨著熒光定量PCR技術(shù)的不斷改進(jìn)和完善，它將在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域和生產(chǎn)實(shí)踐中發(fā)揮出更大的應(yīng)用價(jià)值.

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