金 華， 郭光瓊， 李 江， 肖高鵬， 趙 強， 李艷華

臨床較為常見的胸、腹主動脈瘤、脊柱骨折、脊髓供血動脈疾患、脊髓內(nèi)顯微外科手術(shù)、骶管腫瘤手術(shù)等常導(dǎo)致脊髓缺血損傷(spinal cord Ischemia injury，SCII)，引起急性或遲發(fā)性截癱的發(fā)生，嚴重影響患者生活質(zhì)量。建立標準可靠的動物模型對了解脊髓缺血再灌注損傷的病理生理機制，并進一步研究脊髓保護和治療方案至關(guān)重要。目前通過結(jié)扎主動脈模擬臨床脊髓血供障礙的模型多數(shù)在兔、狗、豬等較大型動物實現(xiàn)，而對大鼠施行上述手術(shù)存在操作難度大、可重復(fù)性差等問題。本實驗對傳統(tǒng)脊髓缺血損傷模型進行改進，對大鼠腎下腹主動脈結(jié)扎同時切斷腎上腹主動脈發(fā)出的椎動脈以確保腰段脊髓血供被完全阻斷。此外，經(jīng)股動脈置入導(dǎo)管既可以檢測阻斷部位以下血壓，又能成為局部注射藥物或生物制劑治療脊髓缺血的途徑。本研究建立SCII改良動物模型并研究其對大鼠神經(jīng)行為學(xué)的影響，為進一步研究脊髓缺血損傷的病理機制和治療方案提供方法學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和分組 清潔級健康成年雌性SD大鼠56只，體重(220±10)g，隨機分為7組，每組8只。假手術(shù)(A)組僅行單純手術(shù)操作但不結(jié)扎腹主動脈;對照1(B)組行腎下腹主動脈結(jié)扎術(shù)60min后開放腹主動脈實現(xiàn)脊髓再灌注;對照2(C)組結(jié)扎腎下腹主動脈90min后再灌注;對照3(D)組結(jié)扎腎下腹主動脈120min后再灌注;改良1(E)組行腎下腹主動脈結(jié)扎術(shù)并切斷腎上腹主動脈發(fā)出的椎動脈，阻斷血供60min后開放腹主動脈再灌注。改良2(F)組行腎下腹主動脈結(jié)扎術(shù)和椎動脈切斷術(shù)，阻斷血供90min后再灌注;改良3(G)組行腎下腹主動脈結(jié)扎術(shù)和椎動脈切斷術(shù)，阻斷血供120min后再灌注。實驗動物由昆明醫(yī)學(xué)院實驗動物科提供［實驗動物質(zhì)量合格證號:SYXK(滇)2005-0004］。

清潔級健康成年雌性SD大鼠56只，體重(220±10)g，隨機分為7組，每組8只。假手術(shù)(A)組僅行單純手術(shù)操作但不結(jié)扎腹主動脈;對照(B、C、D)組行腎下腹主動脈結(jié)扎術(shù)，分別阻斷腹主動脈60min、90min、120min 后開放，脊髓再灌注;改良(E、F、G)組切斷腎上腹主動脈發(fā)出的椎動脈后結(jié)扎腎下腹主動脈，分別阻斷血供60min、90min、120min后開放腹主動脈再灌注。實驗動物由昆明醫(yī)學(xué)院實驗動物科提供［實驗動物質(zhì)量合格證號:SYXK(滇)2005-0004］。

1.2 缺血再灌注模型的建立和改進

1.2.1 麻醉與檢測 以3.6%的水合氯醛(1ml/100g)腹腔注射麻醉動物，左側(cè)后肢根部去毛消毒，剪開皮膚，暴露左側(cè)股動脈，明視下行股動脈穿刺置入24號動脈套管針，接壓力傳感器，以飛利浦M8003A型監(jiān)護儀(德國)監(jiān)測股動脈平均壓(MAP)和脈率(PR)。將溫度探頭插入大鼠肛門持續(xù)監(jiān)測肛溫(Tr)，以燈泡維持大鼠肛溫于37℃ ～38℃。分別記錄各組腹主動脈阻斷前(基礎(chǔ)值)、阻斷10min、再灌注10min時的上述指標。術(shù)中視大鼠體動和呼吸情況半量追加水合氯醛以維持麻醉效果。

1.2.2 動物模型制作 取右側(cè)臥位固定大鼠，縱行切開左側(cè)腹部皮膚2～3cm，鈍性分離皮下組織，暴露后腹膜。游離左腎動脈及其上、下各約1.5 cm長的腹主動脈，注意保護淋巴管。以雙極電凝(威利FxTM-8C型電刀，美國)切斷左腎上動脈分支以上腹主動脈向脊髓發(fā)出的椎動脈，隨后于左腎動脈開口下方以4號絲線結(jié)扎腹主動脈，阻斷血供。阻斷時，以股動脈壓力波形消失，MAP≤10mmHg(1.33kPa)為標準;開放時，以股動脈壓力波形恢復(fù)為標準。動脈結(jié)扎前經(jīng)股動脈推注肝素20U預(yù)防血栓形成。術(shù)畢認真檢查手術(shù)部位沒有滲血后逐層縫合。術(shù)后所有大鼠每天腹腔注射青霉素(20萬U)預(yù)防感染，對于術(shù)后截癱的動物，每天早晚各一次按摩膀胱排尿，必要時給予開塞露排便。

1.2.3 標本采集和處理 術(shù)后48h對實驗動物取材，所有大鼠麻醉后仰臥固定，開胸左心室插管至主動脈弓，右心耳剪一小口，生理鹽水灌注至清亮液體流出后將大鼠俯臥固定，切開背部皮膚和脊柱兩側(cè)肌肉，咬骨鉗咬開椎板，充分暴露脊髓，取出整個脊髓。截取L2節(jié)段脊髓置于4%多聚甲醛內(nèi)作后固定，再將標本分別置于15%和30%梯度蔗糖液內(nèi)脫水。使用恒冷式切片機(Leica公司)連續(xù)冰凍切片，片厚20μm，貼片后37℃烤干備用。

1.3 模型評價指標

1.3.1 神經(jīng)行為學(xué)評價 采用Basso［1］等提出的BBB評分體系于術(shù)后12h、24h和48h對所有大鼠進行行為學(xué)評估，包括0～21級，完全功能缺失為0分，完全正常鼠為21分，評價的內(nèi)容主要包括大鼠后肢的運動、軀干位置及穩(wěn)定性、步態(tài)、協(xié)調(diào)性、爪的置放、足趾間隙以及尾的位置等。評分者為3位熟悉評分標準的非本組實驗人員，評分后取平均值。

1.3.2 NeuN免疫組織化學(xué)染色及脊髓前角正常神經(jīng)元計數(shù) 采用PV-9000兩步法進行免疫組織化學(xué)染色:0.01mol PBS沖洗切片5min×3次;3%H2O2去離子水浸泡10min，蒸餾水沖洗5min×2次;0.01mol PBS沖洗5min×3 次，甩去 PBS，5%羊血清封閉液室溫下孵育30min;在切片上滴加兔抗大鼠NeuN(1∶200，Chimecon，美國)，陰性對照以0.01 mol PBS替代一抗，4℃過夜;次日0.01mol PBS沖洗5min×3次，切片上滴加適量試劑1(PV-9000試劑盒)，室溫下孵育30min;0.01mol PBS沖洗5min×3次，甩去PBS，切片上滴加適量試劑2(PV-9000試劑盒)，室溫下孵育30min;0.01mol PBS沖洗5min×5次，甩去PBS，切片上滴加一滴新鮮配制的DAB顯色液，室溫下顯色3～5min，切片放入蒸餾水中終止顯色;將切片置入蘇木素染液中復(fù)染1min，自來水洗去玻片上多余雜液，返藍液返藍30s;常規(guī)脫水、透明，中性樹膠封固;采用 leica application V 3.3.0數(shù)碼成像系統(tǒng)對切片進行圖像采集，觀察脊髓組織病理學(xué)改變，并計數(shù)第Ⅷ、Ⅸ板層正常神經(jīng)元(正常神經(jīng)元定義標準［2，3］:細胞呈多角形，胞漿染為紅色，內(nèi)有正常的尼氏體;胞核居中，呈圓形，輪廓清晰，核仁明顯;胞體直徑30～60μm。同時滿足以上標準者為正常神經(jīng)元)。

2 結(jié)果

2.1 生理指標 各組間MAP、PR、Tr基礎(chǔ)值差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);與本組基礎(chǔ)值比較，B、C、D、E、F、G 組 MAP 于阻斷 10min 時顯著降低(P＜0.01)，再灌注10min時明顯回升(與同組阻斷10min比較，P ＜0.01)但仍低于基礎(chǔ)值(P ＜0.01);各組PR和Tr于各時點變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)(見表1)。

2.2 神經(jīng)行為學(xué)評分(BBB評分) 與A組比較，各組行腹主動脈阻斷術(shù)大鼠BBB評分于術(shù)后12h、24h、48h 均顯著降低(P ＜0.01)，其中以12h 時降低最為顯著，隨時間延長，各組BBB評分存在不同程度的回升(與同組前一時間點比較，P＜0.01);D組BBB評分于術(shù)后3個時間點均低于B組和C組(P ＜0.01)，而明顯高于 E、F、G 組評分(P ＜0.01);B組與C組比較，BBB評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Ρ＞0.05);E組術(shù)后3個時間點BBB評分均顯著高于F組和G組(P＜0.01)，G組評分于術(shù)后12h、24h與 F組比較無差異(Ρ ＞0.05)，于術(shù)后48h低于F組(P＜0.01)(見表2)。

2.3 病理學(xué)觀察及神經(jīng)元計數(shù) A組脊髓灰質(zhì)內(nèi)可見大量大小不一的NeuN免疫陽性細胞分布，前角Ⅷ、Ⅸ板層神經(jīng)元胞體體積明顯大于周圍的細胞，細胞呈多角形，胞體呈特征性的突起結(jié)構(gòu)，細胞核深染，體積大而圓，核仁明顯，而胞漿和突起染色較淺。F、G組大量神經(jīng)元出現(xiàn)胞體萎縮、空泡樣變，胞漿中尼氏體消失，細胞核破裂，染色質(zhì)溶解、邊聚，Ⅷ、Ⅸ板層內(nèi)正常神經(jīng)元數(shù)明顯低于其它各組(Ρ＜0.01)。E組僅部分神經(jīng)元出現(xiàn)胞核溶解、破裂，Ⅷ、Ⅸ板層內(nèi)正常神經(jīng)元數(shù)低于 A組(P＜0.01)。B、C、D 組灰質(zhì)內(nèi)細胞形態(tài)及Ⅷ、Ⅸ板層內(nèi)神經(jīng)元數(shù)量與A組相比無差異(P＞0.05)。

表1 7組大鼠不同時刻MAP、PR、Tr的比較(χ ± s，n=8)

表2 7組大鼠術(shù)后不同時刻BBB評分比較(χ ± s，n=8)

3 討論

本實驗通過電凝腎上腹主動脈發(fā)出的椎動脈和結(jié)扎腎下腹主動脈阻斷腰段脊髓血液供應(yīng)的方法，有效降低阻斷后股動脈壓力，并于開放腹主動脈后實現(xiàn)脊髓再灌注。改良脊髓缺血再灌注損傷模型可以明顯降低大鼠術(shù)后12h、24h、48h BBB評分，且缺血90min、120min再灌注可導(dǎo)致大鼠BBB評分降低更為明顯，脊髓前角運動神經(jīng)元大量死亡，說明改良的脊髓缺血再灌注損傷模型是一種科學(xué)可靠的動物試驗?zāi)Ｐ汀?/p>

盡管改進外科手術(shù)技術(shù)和應(yīng)用多種脊髓保護措施，SCII發(fā)生率近年來呈上升趨勢，且治療棘手。脊髓損傷程度與缺血時間密切相關(guān)，缺血時間越長，損傷程度越重，甚至進入不可逆損傷期。因此，研究脊髓缺血損傷的防治前提是根據(jù)具體研究目的做出科學(xué)合理的實驗動物模型，闡明其病理機制并尋找合理的治療途徑。目前局灶性脊髓缺血模型制作的主要方法為:夾閉法、體外松解法、氣囊栓塞法和脂肪栓塞法［4］。

大量研究證實對主動脈結(jié)扎能夠有效地模擬臨床常見的由于動脈供血不足或障礙所造成的SCII。姚俊巖［5］等對新西蘭大白兔腎下腹主動脈分別結(jié)扎20min、25min、30min、40min 和 60min，再灌注 48h 后出現(xiàn)截癱的發(fā)生率分別為0%、30%、80%、90%及100%，脊髓組織出現(xiàn)神經(jīng)細胞腫脹、壞死等改變，且損傷程度隨阻斷時間的延長而逐漸加重。管玉龍［6］等鉗夾降主動脈30min后再灌注，術(shù)后3h～7d 83.3%小型豬后肢肌力下降為0～Ⅰ級，電鏡觀察到髓鞘板層結(jié)構(gòu)松解、軸索收縮。肖紅［7］等對家犬腎前及腎后腹主動脈分別鉗夾30min、60min、90min及120min后開放腹主動脈再灌注，結(jié)果腎前型阻斷動物全部死亡，而腎后型阻斷動物均存活，但無一只動物出現(xiàn)脊髓神經(jīng)功能損傷特征性表現(xiàn)。主動脈阻斷法是指在主動脈水平阻斷血流以減少脊髓血供，該方法較為簡單，應(yīng)用廣泛。由于胸主動脈阻斷在致脊髓損傷的同時也可導(dǎo)致肝、腎等重要臟器的損傷，降低動物存活率。為了避免或減輕重要臟器的損傷，提高動物存活率，本實驗采用腎下腹主動脈結(jié)扎術(shù)阻斷腰段脊髓血液供應(yīng)，建立脊髓缺血再灌注損傷模型。單純阻斷腎下腹主動脈 60min、90min、120min再灌注48h，所有大鼠均存活，后肢活動障礙不明顯，BBB評分于術(shù)后12h低于假手術(shù)組，隨后逐漸回升，并于48h恢復(fù)到18分以上，且脊髓灰質(zhì)神經(jīng)元未見明顯壞死，前角正常運動神經(jīng)元數(shù)量無減少?？梢姡瑔渭冏钄啻笫竽I下腹主動脈不能完全造成腰段脊髓缺血，需要繼續(xù)改善該動物模型。

大鼠以其繁殖力強、易于飼養(yǎng)、價格便宜等特點成為各類研究最常應(yīng)用的實驗動物之一，對大鼠建立脊髓缺血再灌注損傷模型具有良好的實用價值和推廣前景。然而大鼠的解剖結(jié)構(gòu)和生理特性與其它實驗動物存在一定的差異。對大鼠解剖發(fā)現(xiàn)其胸腰段脊髓的血供相當豐富，幾乎每組神經(jīng)根或每隔一組神經(jīng)根就伴有根動脈通向脊髓前后方，阻斷腎下腹主動脈后用亞甲藍灌注發(fā)現(xiàn)腰段脊髓被染成藍色，可見腎上腹主動脈發(fā)出的椎動脈可能向尾端發(fā)出側(cè)枝營養(yǎng)腰段脊髓?；诖?，本實驗采用雙極電凝切斷腎上腹主動脈發(fā)出的椎動脈，在最大限度地減少腰段脊髓血液代償供應(yīng)的同時不影響肝、腎等重要腹腔臟器的血液供應(yīng)，再聯(lián)合腎下腹主動脈結(jié)扎術(shù)即可實現(xiàn)對腰段脊髓血供的有效阻斷。

本研究中，改良(E、F、G)組術(shù)后3個時間點BBB評分均顯著低于對照(B、C、D)組和假手術(shù)組，以F、G組降低最為明顯，且該兩組動物出現(xiàn)排便障礙，脊髓灰質(zhì)神經(jīng)元大量壞死，前角正常運動神經(jīng)元數(shù)量明顯低于其它各組?？梢?，改良的脊髓缺血再灌注損傷模型阻斷90min以上能夠有效阻斷大鼠脊髓腰段血液供應(yīng)，導(dǎo)致大鼠神經(jīng)行為學(xué)障礙及脊髓病理組織結(jié)構(gòu)改變，是研究脊髓缺血損傷和再生修復(fù)機制的理想模型。

因此，電凝腎上腹主動脈發(fā)出椎動脈聯(lián)合結(jié)扎腎下腹主動脈可有效阻斷腰段脊髓血液供應(yīng)，且脊髓常溫下耐受缺血時限為90min。改良模型是一種科學(xué)可靠的脊髓缺血再灌注損傷動物模型，可以在脊髓損傷保護研究中推廣應(yīng)用。

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