崔平平，張明珠，稅艷青，徐 杰，趙瑜敏，雷雅燕

(昆明醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔內(nèi)科，云南昆明650031)

流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)牙周病與全身性疾病有關(guān)［1］，牙周病可能是冠心病的一個(gè)重要的危險(xiǎn)因素。動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，其斑塊的破裂可觸發(fā)急性冠脈綜合癥(ACS)的發(fā)生，表現(xiàn)為不穩(wěn)定心絞痛、急性心肌梗塞和猝死。在促進(jìn)AS和RS發(fā)生、發(fā)展的眾多因素中，越來越多的實(shí)驗(yàn)證實(shí)炎癥和細(xì)胞因子是主要的危險(xiǎn)因素，其中TNFα、IL－1與AS的關(guān)系較為密切。血液炎性細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞和 VSMCs均能分泌TNF－α、IL－6、IL－8 及血小板活化因子(PAF)，且這些因子之間具有復(fù)雜的交互作用［2］。

牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis，Pg)是牙周病的主要可疑致病菌，研究發(fā)現(xiàn)在動(dòng)脈粥樣斑塊中存在 Pg 的 DNA［3－4］，但其在 AS 發(fā)生及發(fā)展中的作用機(jī)制目前尚不清楚，本研究試圖通過觀察Pg上清液對(duì)體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)合成分泌細(xì)胞因子的變化，探討Pg對(duì)AS可能的影響，為研究牙周炎與動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要材料和試劑

牙齦卟啉單胞菌ATCC 33277株(四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室);抗人第Ⅷ因子相關(guān)抗原單克隆抗體(福建邁新);噻唑藍(lán)(MTT sigma公司，美國(guó) );Rabbit IL－1β ELISA KIT、Rabbit IL－6 ELISA KIT(R＆D公司，美國(guó));高純總 RNA快速提取試劑盒(離心柱型，北京遠(yuǎn)泰生物技術(shù)有限公司);TaKaRa PrimeScript One Step RT－PCR Kit Ver.2(TaKaRa 公司);兔 β－actin、IL－1β、IL－6 引物(大連寶生物公司)。

1.2 Pg的培養(yǎng)及上清的提取

取Pg標(biāo)準(zhǔn)菌株常規(guī)復(fù)蘇后接種于加有羊血及VitK1的CDC培養(yǎng)板上，37℃厭氧(800 mL/L N2、100 mL/L H2、100 mL/L CO2)培養(yǎng)72 h，形態(tài)學(xué)檢查后，挑取菌落轉(zhuǎn)種于BHI液體培養(yǎng)基中增菌24 h。然后取100 μL增菌菌液在硫乙醇酸鹽中以1/10的比例倍比稀釋至原始濃度的10－7，分別取10－5、10－6、10－7三個(gè)濃度的稀釋液各 100 μL 分別在CDC培養(yǎng)板上涂板，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后計(jì)菌落數(shù)，推算出原始菌液的濃度。其余增菌菌液8 000 r/min，4℃離心15 min，取Pg上清過濾后分裝入1.5 mL EP管，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)的培養(yǎng)及鑒定

人臍靜脈均來自昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院產(chǎn)科，經(jīng)產(chǎn)婦知情同意后，剪取臍帶15～20 cm，PBS沖洗，用1g/L I型膠原酶37℃消化15 min，1 000 r/min離心10 min;加入培養(yǎng)液5 mL吹打成細(xì)胞懸液，以5×107/L～1×108/L的細(xì)胞密度轉(zhuǎn)移至25 cm2的培養(yǎng)瓶中，37℃、50 mL/L CO2條件下培養(yǎng)并傳代，12 h換液1次。取第3代細(xì)胞進(jìn)行人第Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化及透射電鏡觀察進(jìn)行細(xì)胞來源鑒定。

1.4 RT－PCR 法檢測(cè) IL－1β 和 IL－6 mRNA 的表達(dá)水平

取第5代HUVECs以2.5×105/mL的密度接種于25 mL培養(yǎng)瓶并隨機(jī)分為兩組，實(shí)驗(yàn)組加入ECM稀釋的5×106CFU/mL的Pg上清液5 mL;對(duì)照組加入等量ECM培養(yǎng)液37℃，50 mL/L CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)6、12、18、24 h提取各組細(xì)胞總 RNA，用下列引物(表1)進(jìn)行一步法RT－PCR反應(yīng):反應(yīng)體系按照94℃預(yù)變性3 min，94℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s，共 35 個(gè)循環(huán)，72℃ 10 min延伸終止反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，紫外儀下觀察，并使用計(jì)算機(jī)圖像采集系統(tǒng)拍照，分析凝膠目的條帶灰度值。以目的基因條帶的灰度值與內(nèi)參β－actin條帶的灰度值的比值作為目的基因表達(dá)強(qiáng)弱的指標(biāo)。

表1 引物序列

1.5 ELISA法檢測(cè) Pg上清對(duì) HUVECs生成IL－1β和 IL－6 蛋白水平的影響

取第5代HUVECs以5×104/mL的密度接種于96孔培養(yǎng)板，上述條件培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組加入用ECM稀釋的5×106CFU/mL的Pg上清液200 μL;對(duì)照組加入等量ECM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)6、12、18、24 h取各組細(xì)胞，每組復(fù)6孔，ELISA法檢測(cè)HUVECs生成IL－1β和IL－6蛋白的水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 HUVECs的形態(tài)學(xué)觀察及細(xì)胞鑒定

倒置顯微鏡下觀察內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)3 d后完全融合形成“鋪路石”樣的單層細(xì)胞。細(xì)胞呈多角形或橢圓形，邊界清楚，胞漿豐富，細(xì)胞核較大，有1～3個(gè)核仁(圖1)。免疫組化檢測(cè)抗人第Ⅷ因子相關(guān)抗原陽性(圖2黑色箭頭示)。透射電鏡觀察，HUVECs核膜清晰，胞漿內(nèi)富含微管、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)。且可見HUVECs特征性標(biāo)志的Weibel－Palade(W－P)小體，其橫切面呈圓形，周圍有膜包繞;縱切面呈桿狀，其中可見小管狀結(jié)構(gòu)(圖3～4，黑色箭頭示W(wǎng)－P小體)。

圖1 原代培養(yǎng)第3天的HUVECs形態(tài) (×10)

圖2 UVECs免疫組化鑒定(×40)

圖3 HUVECs的超微結(jié)構(gòu)(W－P小體橫切面)

圖4 HUVECs的超微結(jié)構(gòu)(W－P小體縱切面)

2.2 Pg上清液對(duì) HUVECs IL－1β 和 IL－6 mRNA表達(dá)的影響

RT－PCR反應(yīng)產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果見圖5。以目的基因條帶灰度值與內(nèi)參β－actin條帶灰度值的比值作為目的基因表達(dá)強(qiáng)弱的指標(biāo)，對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，IL－1β mRNA水平在Pg上清液刺激12、18 h時(shí)的表達(dá)高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，刺激 6、24 h 時(shí)兩組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)(圖6);IL－6 mRNA水平在Pg上清液刺激12 h的表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)，而其他各時(shí)間點(diǎn)兩組均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)(圖7)。

2.3 Pg上清液對(duì) HUVECs生成 IL－1β 和 IL－6蛋白水平的影響

IL－1β蛋白在Pg上清液刺激18、24 h的表達(dá)量明顯高于對(duì)照組(P＜0.05);而6、12 h兩組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)(圖8)。IL－6蛋白在Pg上清液刺激12、18、24 h三個(gè)時(shí)點(diǎn)均明顯高于對(duì)照組(P ＜0.05)(圖9)。

圖5 RT－PCR反應(yīng)產(chǎn)物凝膠電泳圖(Treat為實(shí)驗(yàn)組，Control為對(duì)照組)

3 討論

牙周炎是由牙周致病菌導(dǎo)致的一種炎癥性疾病，牙齦卟啉單胞菌是目前公認(rèn)的引起牙周炎的常見致病菌，能表達(dá)多種潛在的毒力因子。魯維希等［5］將 Pg等牙周致病菌的 BHI增菌液進(jìn)行15 000 r/min離心10 min后取其上清液用核磁共振代謝圖譜法進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，Pg菌液經(jīng)高速離心后的上清液內(nèi)保留了Pg的主要致病成分，可代表Pg的毒性成分，所以本實(shí)驗(yàn)選擇 Pg上清液與HUVECs共同培養(yǎng)，觀察其對(duì) HUVECs合成、分泌IL－6和 IL－1β 的影響。

另外，我們前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Pg上清液在高濃度(＞5×106CFU/mL)時(shí)，對(duì) HUVECs的增殖有明顯的抑制作用，在相對(duì)低濃度(≤5×106CFU/mL)時(shí)對(duì) HUVECs的增殖則無明顯影響。故選擇對(duì)細(xì)胞增殖無明顯抑制作用濃度組中的最高細(xì)菌濃度作為本實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞刺激濃度。

血管內(nèi)皮細(xì)胞在Pg的直接和間接作用下，可通過分泌大量的粘附分子或炎性介質(zhì)促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞的聚集與粘附，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖與遷移，在血管內(nèi)膜下吞噬氧化的脂質(zhì)而形成大量的泡沫細(xì)胞;同時(shí)，由于內(nèi)皮功能受損，內(nèi)膜下的膠原暴露，組織因子大量釋放，引起血小板的活化和血栓形成，共同導(dǎo)致AS的發(fā)生［6］。有研究顯示，Pg纖毛、內(nèi)毒素、細(xì)菌外膜蛋白和熱休克蛋白可刺激人內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)血管間細(xì)胞粘附分子(VCAM－1)、細(xì)胞間粘附分子(ICAM－1)、E－選擇素和P－選擇素等，并觀察到其炎癥基因表達(dá)上調(diào)［7－8］。

白細(xì)胞介素 －1(interieukin－1，IL－l)是一種強(qiáng)效的炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)因子，主要由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等產(chǎn)生，具有調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和介導(dǎo)炎癥反應(yīng)發(fā)生的雙重作用。Bhaskar等［9］研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)運(yùn)用抗IL－lβ抗體可抑制載脂蛋白缺陷鼠動(dòng)脈斑塊的形成。Wang等［10］認(rèn)為，IL－lβ 濃度可作為診斷急性冠脈綜合征的炎癥指標(biāo)。

IL－6是一種多功能細(xì)胞因子，可由成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、成骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞合成分泌。近年的流行病學(xué)研究和臨床研究提示:IL－6是心血管疾病有力的獨(dú)立預(yù)示因子之一。Lai等［11］認(rèn)為，IL－6可能是判斷心血管疾病嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)，與動(dòng)脈硬化斑塊的活動(dòng)性密切相關(guān)。McDermott等［12］認(rèn)為，持續(xù)的高IL－6水平與外周動(dòng)脈疾病快速功能下降有關(guān)。以上研究表明，IL－6是反映動(dòng)脈粥樣硬化演進(jìn)的重要標(biāo)志物，且對(duì)遠(yuǎn)期心血管事件具有預(yù)測(cè)價(jià)值。

本結(jié)果顯示，以5×106CFU/mL濃度的Pg上清液刺激HUVECs后，細(xì)胞上清中的IL－1β和IL－6的基因表達(dá)增強(qiáng)，蛋白表達(dá)水平均增高，而且其基因的高表達(dá)早于相應(yīng)蛋白的表達(dá)。提示，Pg可通過促進(jìn) HUVECs的 IL－1β、IL－6的表達(dá)，從而在AS的發(fā)生發(fā)展中起到促進(jìn)推動(dòng)作用。但是，牙周炎對(duì)AS的影響究竟是通過致病菌毒力因子直接刺激內(nèi)皮細(xì)胞而導(dǎo)致的炎癥因子水平升高，還是通過局部組織炎癥因子的釋放使得外周血液中IL－1β和IL－6水平升高從而對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮間接的損傷作用，還有待進(jìn)一步的探索。

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