何保山，左春艷，王 丹，王金水

（1.河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001）

維生素C的紫外分光光度法測(cè)定研究

何保山1，左春艷1，王 丹1，王金水2

（1.河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001）

應(yīng)用紫外分光光度法分析技術(shù)建立了快速測(cè)定維生素C的檢測(cè)方法.利用樣品中維生素C在弱酸條件下將三價(jià)鐵離子還原為亞鐵離子，生成的亞鐵離子與鄰二氮菲形成橙紅色絡(luò)合物，在最大吸收波長(zhǎng)510 nm處生成物吸光值與樣品中維生素C質(zhì)量濃度成比例，結(jié)果顯示維生素C質(zhì)量濃度在1～30 μg/mL的范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.998，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.3%～1.0%，加標(biāo)回收率為97.18%～102.67%.方法操作簡(jiǎn)便、可靠，可以用于樣品中維生素C的快速測(cè)定.

紫外分光光度法；快速測(cè)定；維生素C；鄰二氮菲

0 前言

維生素C是人體重要的維生素之一，廣泛存在于植物組織中，如新鮮的水果、蔬菜，特別是棗、辣椒、獼猴桃、柑橘等食品中.作為人體正常生理代謝的一種重要化合物，維生素C廣泛參與機(jī)體氧化還原等復(fù)雜代謝過程，維持體內(nèi)多種支持組織及細(xì)胞間質(zhì)的生成，促進(jìn)生長(zhǎng)和抗體的形成，增強(qiáng)免疫活性，人體缺乏維生素C時(shí)會(huì)患?jí)难。示S生素C又稱抗壞血酸［1］.另外，維生素C被用作營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑、抗氧化劑、增效劑添加在食品中，對(duì)食品既起到品質(zhì)改良、穩(wěn)定風(fēng)味作用，又具有保鮮功能.因此，對(duì)維生素C測(cè)定方法的研究對(duì)人體醫(yī)療保健、健康飲食、食品保鮮等方面都具有重要的現(xiàn)實(shí)意義.

近年來文獻(xiàn)報(bào)道維生素C的測(cè)定方法主要有滴定法［2-4］、化學(xué)發(fā)光分析法［5-6］、高效液相色譜法［7-8］和電化學(xué)［9-11］等.其中，滴定法是一種傳統(tǒng)和經(jīng)典的維生素C檢測(cè)方法，具有結(jié)果直觀、方便實(shí)用的特點(diǎn)，但操作步驟比較繁瑣，測(cè)量結(jié)果容易受樣品中其他有色物質(zhì)的干擾.化學(xué)發(fā)光分析法和高效液相色譜法是20世紀(jì)60年代以后發(fā)展起來的檢測(cè)技術(shù)，應(yīng)用于維生素C的檢測(cè)具有靈敏度高、結(jié)果可靠的特點(diǎn)，但通常檢測(cè)所需的儀器比較昂貴，且需要專業(yè)人士操作，應(yīng)用范圍受到一定的限制.電化學(xué)法是將被測(cè)物質(zhì)濃度轉(zhuǎn)化為一種電信號(hào)加以測(cè)量的分析方法，與常規(guī)分析方法相比，具有儀器設(shè)備簡(jiǎn)單、便于攜帶、易自動(dòng)化的特點(diǎn)，但這種分析方法易受其他物質(zhì)干擾，目前尚處于研究階段.

筆者利用維生素C在弱酸條件下與三價(jià)鐵離子和鄰二氮菲間的特異性顯色反應(yīng)，基于紫外分光光度裝置建立了快速測(cè)定維生素C的分析方法，并對(duì)反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，取得了滿意的結(jié)果.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

維生素C：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；鄰二氮菲：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硫酸鐵銨：天津市瑞金特化學(xué)品有限公司；冰乙酸：開封市芳晶化學(xué)試劑有限公司；三水合乙酸鈉、氫氧化鈉：汕頭市西隴化工廠有限公司.所用試劑均為分析純，所用水為二次蒸餾水.試驗(yàn)在室溫下進(jìn)行.

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司.

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 緩沖溶液（pH 4.75）的配制

準(zhǔn)確稱取13.6 g三水合乙酸鈉、準(zhǔn)確量取6 mL乙酸置于50 mL蒸餾水中，充分溶解，用1%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至4.75，備用.

1.3.2 鄰二氮菲﹙4.0 mg/mL﹚的配制

準(zhǔn)確稱取4.0 mg鄰二氮菲置于1 000 μL的緩沖溶液中，充分溶解，備用.

1.3.3 硫酸鐵銨﹙2.4 mg/mL﹚的配制

準(zhǔn)確稱取2.4 mg鄰二氮菲置于1 000 μL的緩沖溶液中，充分溶解，備用.

1.3.4 維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液(2.5 mg/mL)的配制

準(zhǔn)確稱取2.5 mg維生素C樣品置于1 000 μL的緩沖溶液中，充分溶解.

1.3.5 樣品中維生素的測(cè)定

測(cè)試時(shí)，首先分別移取150 μL鄰二氮菲、150 μL硫酸鐵銨、2 150 μL緩沖溶液至比色皿中，再移取50 μL檢測(cè)試樣至比色皿中，立即置于TU-1901雙光束紫外分光光度計(jì)中測(cè)量其在波長(zhǎng)510 nm的吸光值，通過吸光值與維生素C質(zhì)量濃度間的響應(yīng)關(guān)系得知樣品中維生素C的含量.

2 結(jié)果與分析

2.1 維生素C與顯色劑間生成物最大吸收波長(zhǎng)的確定

試驗(yàn)中首先對(duì)維生素C與顯色劑間結(jié)合反應(yīng)的光譜特點(diǎn)進(jìn)行考察.分別對(duì)游離的顯色劑 （鄰二氮菲、硫酸鐵銨）溶液以及維生素C與顯色劑間的反應(yīng)溶液進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果如圖1所示.由圖1可以看出，在200～900 nm之間的整個(gè)掃描區(qū)間內(nèi)，游離顯色劑溶液并沒有明顯的吸收峰 （圖1中曲線1）.當(dāng)溶液中引入維生素C后，游離顯色劑與維生素C間發(fā)生快速顯色反應(yīng)，光譜曲線在波長(zhǎng)510 nm處出現(xiàn)了明顯的吸收峰（圖1中曲線2），峰值為2.285，此應(yīng)為游離的顯色劑與維生素C反應(yīng)后生成物的特征吸收峰.因此，試驗(yàn)中將顯色反應(yīng)的最大吸收波長(zhǎng)定為510 nm.

圖1 顯色劑與維生素C間的光譜掃描曲線

2.2 反應(yīng)時(shí)間的確定

試驗(yàn)中將測(cè)量波長(zhǎng)點(diǎn)定為510 nm，依次移取100 μL鄰二氮菲、100 μL硫酸鐵銨、2 250 μL補(bǔ)充液和50 μL的維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液置于比色皿中充分混合，在紫外可見光分光光度計(jì)上進(jìn)行時(shí)間掃描，結(jié)果如圖2所示.由圖2可以看出，維生素C與顯色劑間的結(jié)合反應(yīng)非常迅速，1 min后生成物吸光值即可達(dá)到穩(wěn)定，因此，選擇反應(yīng)時(shí)間為1 min.

圖2 維生素C與顯色劑間反應(yīng)的時(shí)間掃描曲線

2.3 鄰二氮菲用量的優(yōu)化

試驗(yàn)中比色皿內(nèi)引入2.5 mg/mL維生素C溶液50 μL，2.4 mg/mL硫酸鐵銨溶液150 μL，改變鄰二氮菲用量，分別移取0 μL、50 μL、100 μL、150 μL、200 μL 4.0 mg/mL鄰二氮菲溶液置于比色皿中，反應(yīng)1 min，進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果如圖3所示.由圖3可以看出，反應(yīng)體系中隨著鄰二氮菲引入量的增加，在最大吸收波長(zhǎng)510 nm處生成物的吸光值也逐漸增大，當(dāng)鄰二氮菲引入量為150 μL時(shí)，峰值最大，當(dāng)引入量超過150 μL時(shí)，峰值下降，因此，將鄰二氮菲的引入量定為150 μL.

圖3 不同用量的鄰二氮菲與維生素C反應(yīng)的光譜掃描曲線

2.4 硫酸鐵銨用量的優(yōu)化

試驗(yàn)中比色皿內(nèi)引入2.5 mg/mL維生素C溶液50 μL，4.0 mg/mL鄰二氮菲溶液150 μL，改變硫酸鐵銨用量，分別移取0 μL、50 μL、100 μL、150 μL、200 μL、250 μL 4.0 mg/mL硫酸鐵銨溶液置于比色皿中，反應(yīng)1 min，進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果如圖4所示.由圖4可以看出，反應(yīng)體系中隨著硫酸鐵銨引入量的增加，在最大吸收波長(zhǎng)510 nm處生成物的吸光值也逐漸增大，當(dāng)硫酸鐵銨引入量大于150 μL時(shí)，峰值超過儀器檢測(cè)上限，且峰形出現(xiàn)了較多尖銳的凸起，體系不再穩(wěn)定，這說明此時(shí)結(jié)合反應(yīng)需要更長(zhǎng)的時(shí)間才能完成，因此，將硫酸鐵銨的引入量定為150 μL.

圖4 不同用量的硫酸鐵銨與維生素C反應(yīng)的光譜掃描曲線

2.5 其他還原性物質(zhì)對(duì)吸光值的影響

試驗(yàn)中將果糖、葡萄糖作為干擾物質(zhì)引入維生素C和鄰二氮菲、硫酸鐵銨的反應(yīng)體系中，結(jié)果顯示，在相同試驗(yàn)條件下，上述兩種物質(zhì)不與鄰二氮菲、硫酸鐵銨發(fā)生反應(yīng)，在最大吸收波長(zhǎng)510 nm處不產(chǎn)生吸收（圖5），對(duì)顯色反應(yīng)不產(chǎn)生影響.這說明本方法抗干擾能力強(qiáng)，對(duì)樣品中維生素C的選擇性高.

圖5 果糖、葡萄糖對(duì)顯色反應(yīng)的影響

2.6 樣品的測(cè)定

在最優(yōu)化的檢測(cè)條件下，應(yīng)用上述建立的紫外分光光度法對(duì)質(zhì)量濃度為1～30 μg/mL的維生素C樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖6所示.

由圖6可以看出，維生素C在1～30 μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，吸光值與維生素C質(zhì)量濃度呈線性相關(guān)，線性方程為y=0.046x+0.161，相關(guān)系數(shù)R=0.998.

圖6 維生素C質(zhì)量濃度與吸光值的擬合直線圖

2.7 樣品分析

準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的市售草莓、青椒、檸檬，加入一定體積的緩沖液用紗布包裹放入干凈的研缽中進(jìn)行研磨，至漿狀.取一定量樣液置于離心管中，加入緩沖液，使總體積為1.5 mL，將離心管放入離心機(jī)內(nèi)離心.準(zhǔn)確移取50 μL上清液應(yīng)用上述建立的紫外分光光度法在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度值，根據(jù)已有的標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可得出樣液中維生素C的含量.每種樣品平行測(cè)定3次，同時(shí)測(cè)定加標(biāo)回收率,所得結(jié)果見表1.

表1 蔬菜、水果中維生素C含量的測(cè)定

3 結(jié)論

本研究基于維生素C與鄰二氮菲、硫酸鐵銨間的快速顯色反應(yīng)，其生成物的吸光值與樣品中維生素C質(zhì)量濃度呈比例，建立了維生素C的光紫外分光光度法分析技術(shù)，反應(yīng)時(shí)間1 min，在1～30 μg/mL的維生素C質(zhì)量濃度范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.3%～1.0%，回收率為97.18%～102.67%，實(shí)現(xiàn)了樣品中維生素C含量的快速定量檢測(cè).

［1］ Antonelli M L,D'Ascenzo G,Laganà A,et al. Food analyses：a new calorimetric method for ascorbic acid(vitamin C)determination［J］.Talata,2002,58：961-967.

［2］ 武文,詹秀環(huán),宣亞文.碘量法測(cè)定蔬菜中維生素C的含量［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,37(21)：9845-9846.

［3］ 葉青,江志波.酸堿滴定法與碘滴定法測(cè)定維生素C［J］.理化檢驗(yàn)-化學(xué)分冊(cè),2007,43(5)：410, 412.

［4］ Kovács-Hadady K,Fábián I.Determination of vi tamin C in effervescent tables containing other vitamins together with trace elements［J］.Journal ofPharmaceuticaland BiomedicalAnalysis, 1996,14：1479-1486.

［5］ 馬泉莉,金永平,尤洪濤.化學(xué)發(fā)光抑制法測(cè)定抗壞血酸［J］.光譜學(xué)與光譜分析,2002,22(6)：888-890.

［6］ 吳東梅,楊佳,汪敬武.固定化酶反應(yīng)柱聯(lián)用流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法測(cè)定抗壞血酸［J］.南昌大學(xué)學(xué)報(bào)：理科版,2007,31(2)：147-149,153.

［7］ Koshiishi I,Mamura Y,Imanari T.Simult-a eous determination of vitamin C and its carbamylated derivatives by high-performance liquid chromatography with postcolumn derivatization［J］. Journal of Chromatography A,1998,806：340-344.

［8］ Romeu-Nadal M,Morera-Pons S,Castellote A I, et al.Rapid high-performance liquid chromatographic method for Vitamin C determination in human milk versus an enzymatic method［J］. Journal of Chromatography B,2006,830：41-46.

［9］ 王亞珍,鄭武.L-半胱氨酸自組裝金電極測(cè)定鮮橙多中抗壞血酸的含量［J］.化學(xué)傳感器,2008,28 (3)：53-57.

［10］ Thangamuthu R,Kumar S M S,Pillai K C. Direct amperometric determination of l-ascorbic acid (Vitamin C)at octacyanomolybdatedoped-poly(4-vinylpyridine)modified electrode in fruit juice and pharmaceuticals［J］. Sensors and Actuators B,2007,120：745-753.

［11］ 萬其進(jìn),喻玖宏,王剛.聚茜素紅膜修飾電極控制電位掃描法分別測(cè)定多巴胺和抗壞血酸［J］.高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào),2000,21(11):1651-1654.

RESEARCH ON DETERMINATION OF VITAMIN C BY ULTRAVIOLET SPECTROPHOTOMETRY

HE Bao-shan1,ZUO Chun-yan1,WANG Dan1,WANG Jin-shui2
（1.School of Food Science and Technology,Henan University of Technology,Zhengzhou 450001,China; 2.School of Biotechnology Engineering,Henan University of Technology,Zhengzhou 450001,China）

In this paper,we established a new method for fast detecting vitamin C by using ultraviolet spectrophotometery.Under weak acidic conditions,ferric ion was reduced to ferrous ion by vitamin C,and ferrous ion could react with 1,10-phenanthroline to form an orange-red complex,and the absorbance of the complex at the maximal absorption wavelength of 510 nm was proportional to the mass concentration of vitamin C.The results showed that the absorbance of the complex was in good linear realationship with the mass concentration of vitamin C in the range of 1 to 30 μg/mL,with a correlation coefficient of 0.998,relative standard deviation from 0.3%to 1%, and a recovery from 97.18%to 102.67%.

ultraviolet spectrophotometery;rapid determination;vitamin C;1,10-phenanthroline

TS201.2

B

1673-2383(2012)04-0025-04

http://www.cnki.net/kcms/detail/41.1378.N.20120829.1722.201204.25_006.html

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2012-08-29 05:22:00 PM

2011-10-09

河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)資助項(xiàng)目(102102310305)；河南省教育廳自然科學(xué)研究資助項(xiàng)目（2011A550002）；鄭州市科技攻關(guān)資助項(xiàng)目(0910SGYS34370-3)；鄭州市科技攻關(guān)資助項(xiàng)目(2010GYXM482)；河南工業(yè)大學(xué)博士基金資助項(xiàng)目(2009BS009)；河南工業(yè)大學(xué)2010年研究生科技創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目(10YJS007)

何保山（1978—），男，河南南陽(yáng)人，博士，講師，主要從事食品工程與品質(zhì)安全控制、傳感器技術(shù)和儀器儀表分析研究.