呂林蘭，董學(xué)興，董斯明，蔣琦辰，楊家新

(1.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇南京210046;2.鹽城工學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院江蘇省沿海池塘養(yǎng)殖生態(tài)重點實驗室，江蘇鹽城224003)

輪蟲是自然水域中分布最為廣泛的浮游動物之一，在水域生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動中具有重要的作用。由于輪蟲棲息地的生態(tài)因子 (如水溫、光照和食物等)存在差異，不同地理品系之間會產(chǎn)生不同程度的遺傳分化，從而在形態(tài)或生理生態(tài)特征上表現(xiàn)出差異［1-3］。20世紀(jì)，研究者發(fā)現(xiàn)褶皺臂尾輪蟲Brachionus plicatilis是復(fù)合體，一些不同地理品系的褶皺臂尾輪蟲實際是姐妹種［1］。目前已發(fā)現(xiàn)的褶皺臂尾輪蟲復(fù)合體至少有14個姐妹種，它們不僅在形態(tài)、生理生態(tài)、遺傳等方面存在差異，而且姐妹種之間存在明顯的生殖隔離［4-8］。相對于褶皺臂尾輪蟲，人們對廣泛分布于淡水中的萼花臂尾輪蟲Brachionus calyciflorus復(fù)合體認(rèn)識時間不長。李化炳等［9-10］研究發(fā)現(xiàn)，萼花臂尾輪蟲姐妹種可形成于同一水域，它們的生活史參數(shù)具有顯著差異。Xiang等［11］研究表明，萼花臂尾輪蟲復(fù)合體有6個姐妹種，并認(rèn)為大多數(shù)姐妹種的遺傳分化與它們的地理距離沒有顯著的相關(guān)性。而Gilbert等［2］研究佛羅里達(dá)、佐治亞、德克薩斯和澳大利亞4個地理品系萼花臂尾輪蟲的基因相似性和交配行為時發(fā)現(xiàn):遺傳差異較大的佛羅里達(dá)、德克薩斯和澳大利亞品系間存在生殖隔離現(xiàn)象，這些特性與它們之間的地理分隔相一致。本研究中，作者以萼花臂尾輪蟲南京品系和美國佛羅里達(dá)品系為研究對象，探討兩品系間和品系內(nèi)的生活史特征和受精作用差異，以是否形成生殖隔離為指標(biāo)評價二者是否是姐妹種，旨在為萼花臂尾輪蟲的生理生態(tài)學(xué)及相應(yīng)領(lǐng)域的研究積累資料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用萼花臂尾輪蟲南京品系 (NJ)樣品采自江蘇省淡水水產(chǎn)研究所養(yǎng)殖池塘(N 32°03'，E 118°75');萼花臂尾輪蟲佛羅里達(dá)品系(FL)休眠卵為美國佐治亞理工學(xué)院Terry W Snell教授贈送。

1.2 方法

1.2.1 輪蟲的采集與培養(yǎng) 在解剖鏡下挑取游泳速度快、個體較大并攜非混交卵的雌體，在實驗室條件下使用EPA培養(yǎng)液進(jìn)行單“克隆”培養(yǎng)［12］，周期性收集休眠卵保種。以蛋白核小球藻Chlorella pyrenoidosa為餌料進(jìn)行投喂，小球藻的培養(yǎng)參照楊家新等［13］的方法，投喂前以4 000 r/min離心10 min，再用 EPA培養(yǎng)液將小球藻密度調(diào)至 (2～3)×106個/mL。試驗在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行，輪蟲培養(yǎng)期間，光照強度為4 000 lx，光照周期L∶D=16∶8，溫度為 (25±1)℃。

1.2.2 單個體培養(yǎng)試驗 分別挑取單個NJ、FL品系(齡期＜4 h)的輪蟲幼體放入24孔塑料培養(yǎng)板中，每孔盛新鮮培養(yǎng)液0.8 mL，各設(shè)24個平行，小球藻密度為 2×106個/mL，培養(yǎng)條件同“1.2.1”。培養(yǎng)12 h后，每小時觀察1次，記錄母體和幼體的發(fā)育時間(首次攜卵)和第一個幼體孵出時間，之后每隔8 h觀察1次，記錄新生幼體數(shù)量，幼體單獨培養(yǎng)至攜卵，辨別其類型。每隔24 h更換1次培養(yǎng)液，試驗至全部母體死亡為止。

1.2.3 生命表構(gòu)建 分別挑取NJ和FL品系的輪蟲幼體 (齡期＜4 h)各10個，置于12孔板中，每孔盛新鮮培養(yǎng)液4 mL，各設(shè)5個平行，培養(yǎng)條件同“1.2.1”。每隔8 h觀察1次，記錄各孔輪蟲的存活數(shù)、死亡數(shù)、幼體數(shù)，并移去幼體、死亡個體，每隔24 h更換1次培養(yǎng)液，試驗至輪蟲個體全部死亡為止。

1.2.4 受精率觀察 將NJ和FL品系的輪蟲進(jìn)行高密度群體培養(yǎng)，誘導(dǎo)混交雌體，觀察到有較多混交雌體出現(xiàn)后，挑取攜卵非混交雌體和攜雄卵的混交雌體進(jìn)行單獨培養(yǎng)，6 h后，分別挑取非混交卵孵出的幼體和雄卵孵出的雄體。試驗共設(shè)計4組(NJ♂×NJ♀，F(xiàn)L♂×FL♀，NJ♂×FL♀，F(xiàn)L♂×NJ♀)，按雌、雄為1∶3的比例放入96孔板中，每孔加100 μL輪蟲培養(yǎng)藻液，24 h后檢查并計算受精率，受精率為受精混交雌體 (帶休眠卵)占所有混交雌體(帶雄卵混交雌體和帶休眠卵混交雌體)的百分比。

1.2.5 雌體類型的鑒定

非混交雌體:產(chǎn)非混交卵，個體較大，卵殼較薄而光滑，無色透明且可見胚胎發(fā)育過程，在胚胎發(fā)育早期可見咀嚼器的幾丁質(zhì)板。

產(chǎn)雄卵的混交雌體:雄卵體積較小，約為非混交卵的1/3，一般帶卵數(shù)量較多，5個以上。

產(chǎn)休眠卵的混交雌體:經(jīng)受精后形成，休眠卵個體較大，具有厚的外殼，外表顏色常呈暗褐色，發(fā)育成熟的休眠卵兩極分化明顯［14］。

1.2.6 種群增長參數(shù)的計算方法

內(nèi)稟增長率rm=ln R0/T，

式中:lx(特定年齡存活率)為x年齡組開始時存活個體的百分?jǐn)?shù);mx(特定年齡繁殖率)為特定年齡出生率，是各年齡組8 h內(nèi)平均每個雌體的產(chǎn)仔數(shù);rm的精確值是在粗略計算的基礎(chǔ)上，根據(jù)方程∑lxmxe-rx=1，通過設(shè)置程序用試算法在Excel中求得。

應(yīng)用軟件SPSS 16.0對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 兩品系萼花臂尾輪蟲的幼體發(fā)育和胚胎發(fā)育歷時及繁殖量的比較

試驗結(jié)果表明:FL和NJ品系幼體的發(fā)育時間分別為(12.95±0.22)、(13.47±0.25)h，體外胚胎發(fā)育時間分別為(10.00±0.17)、(9.31±0.75)h，第一個幼體孵出時間分別為(22.95±0.28)、(22.78±0.27)h，繁殖量分別為(13.75±0.84)、(16.94±1.10)個，除NJ品系比FL品系的胚胎發(fā)育時間顯著縮短6.9%(P＜0.05)外，兩品系間其余指標(biāo)均無顯著差異 (P＞0.05)。

2.2 兩品系萼花臂尾輪蟲的存活率和繁殖率

從圖1可見:FL和NJ品系的存活率在48 h后開始下降，NJ品系的存活時間為160 h，F(xiàn)L品系的存活時間為136 h;NJ品系的繁殖率大于FL品系。NJ品系繁殖率＞2個/8 h的時間占整個生殖期的50%，其最高繁殖率達(dá)到4.1個/8 h;FL品系繁殖率＞2個/8 h的時間占整個生殖期的15.38%。

2.3 兩品系萼花臂尾輪蟲的種群增長參數(shù)

從表1可見，NJ品系的凈生殖率 (R0)、內(nèi)稟增長率 (rm)、世代時間 (T)和生命期望 (e0)分別比 FL大 52.88%、12.50%、10.88%和29.08%(P＜0.05)。

表1 兩品系萼花臂尾輪蟲的種群增長參數(shù)Tab.1 The population growth parameters in two strains of the rotifer B.calyciflorus

2.4 兩品系萼花臂尾輪蟲的受精率

從圖2可見:兩品系萼花臂尾輪蟲FL和NJ品系內(nèi)的受精率均為100%，品系間的受精率相對有所下降，其中FL♂×NJ♀的受精率顯著低于其他各組 (P＜0.05)。

圖1 兩品系萼花臂尾輪蟲的存活率和繁殖率Fig.1 The fecundity and survival rate of amictic female in two strains of the rotifer B.calyciflorus

圖2 兩品系組合萼花臂尾輪蟲混交雌體受精率Fig.2 The amictic female fertilization rate between FL and NJ strains

3 討論

3.1 品系間和品系內(nèi)萼花臂尾輪蟲的生活史特征

已有研究表明，輪蟲品系間或姐妹種之間生命表統(tǒng)計學(xué)參數(shù)差異是由遺傳決定的。Ricci等［15］對蛭態(tài)類Macrotrachela quadricornifera 5個品系的亮氨酸氨肽酶、精氨酸激酶、葡糖磷酸異構(gòu)酶、α和β酯酶及蘋果酸酶進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)各品系間有較高的酶基因多態(tài)位點，僅有27%的等位基因為各克隆共享，認(rèn)為各品系生活史的差異不僅是環(huán)境誘導(dǎo)的表型可塑性，而且存在基因水平的差異。李化柄等［10］研究了萼花臂尾輪蟲3個姐妹種的生命表特征參數(shù)，發(fā)現(xiàn)姐妹種之間存在類似于鐮形臂尾輪蟲B.forcatus和尾突臂尾輪蟲B.caudatus的種間差異。本研究中得到與上述研究類似的結(jié)果，NJ品系和FL品系胚胎發(fā)育時間存在顯著差異，NJ品系輪蟲的凈生殖率、內(nèi)稟增長率、世代時間和生命期望均顯著大于FL品系。

3.2 不同品系萼花臂尾輪蟲的受精率

輪蟲姐妹種的形成機(jī)制尚不清楚，地理隔離或棲息地環(huán)境因子限制了它們的基因交流可能是形成姐妹種的主要原因［11，16］。而對輪蟲姐妹種的判定目前沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)方法(線粒體COⅠ、rDNA ITS和16S rDNA序列)是常用的甄別方法［1-2，5，8-9，11，17］，而利用輪蟲特殊的生活史，觀察有性生殖的發(fā)生和結(jié)果如交配行為、受精率和休眠卵的產(chǎn)生是辨別不同品系是否產(chǎn)生生殖隔離而形成姐妹種的較為簡潔而有效的方法［1-2，4，6，9］。已有的研究表明，生殖隔離與遺產(chǎn)差異具有顯著的相關(guān)性，F(xiàn)u等［4］研究了7個品系(4個L型，3個S型)褶皺臂尾輪蟲的交配試驗，發(fā)現(xiàn)受精率與交配率與基因距離呈負(fù)相關(guān)，遺傳差異大的L型與S型的受精率為零。Gilbert等［2］研究發(fā)現(xiàn)，只有基因水平相近的佛羅里達(dá)和佐治亞萼花臂尾輪蟲品系能發(fā)生交配行為，其他品系之間雄體雖有繞圈行為，但不發(fā)生交配，從而認(rèn)為雄體圍繞雌體繞圈的行為與交配行為分別受兩個不同的信號控制，并認(rèn)為地理學(xué)與遺傳距離具有顯著的相關(guān)性。而Xiang等［11］以rDNA ITS為標(biāo)記分析了中國不同地理群體的萼花臂尾輪蟲的遺傳分化，結(jié)果表明，多數(shù)姐妹種的遺傳分化與溫度和pH具有顯著的相關(guān)性，而與地理學(xué)距離沒有相關(guān)性。另有研究表明，萼花臂尾輪蟲和褶皺臂尾輪蟲姐妹種可產(chǎn)生于同一水域［9，18］。本試驗中以受精率為指標(biāo)評價地理相隔較遠(yuǎn)的NJ品系和FL品系萼花臂尾輪蟲的生殖隔離狀況，發(fā)現(xiàn)兩者品系間受精率雖較品系內(nèi)受精率有所下降，但并不存在生殖隔離，由此證明，不同品系萼花臂尾輪蟲間是否產(chǎn)生生殖隔離而形成姐妹種與其地理學(xué)距離并無相關(guān)性。

本研究結(jié)果表明，不同品系萼花臂尾輪蟲的發(fā)育和種群增長參數(shù)存在顯著差異，但NJ品系和FL品系間不存在完全的生殖隔離，未形成姐妹種。

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