肖 芬，吳建新

（大理學院藥學與化學學院，云南大理 671000）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是以血管平滑肌細胞 （ vascular smooth muscle cells，VSMCs） 增生和脂質(zhì)沉積為特征的嚴重危害人類健康的疾病。隨著現(xiàn)代科學技術(shù)的快速發(fā)展，已發(fā)現(xiàn)血管平滑肌的增殖與凋亡在AS形成過程中起核心作用，異常增殖的VSMCs，往往在形態(tài)上會發(fā)生明顯的改變，如肌絲成分減少，以收縮為主變?yōu)橐栽鲋碁橹?，血管壁增厚?-2〕。而關于AS形成中的氧化學說，已越來越引起人們的重視，過氧化氫（peroxide hydrogen，H2O2）作為外源性氧自由基的來源，已被廣泛地應用于體外氧化應激實驗〔3〕。有研究表明，中藥在防止或延緩AS的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用〔4〕。心脈隆膠囊（XMLJ）是從昆蟲美洲大蠊中提取的一種新型核苷類化合物，對心血管系統(tǒng)具有一定作用〔5〕，但目前未見XMLJ對VSMCs形態(tài)損傷保護作用的療效報道。本實驗旨在用組織貼塊法對原代VSMCs進行體外培養(yǎng)，建立VSMCs氧化應激損傷模型，研究XMLJ對VSMCs形態(tài)損傷的治療效果，為今后臨床治療AS提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 DMEM/F12（Hycolone公司），無支原體胎牛血清（浙江天航生物科技有限公司），LGlntamine（ BIOSHARP生產(chǎn)），心脈隆膠囊（ 云南騰沖制藥廠提供，試驗用200 μg·mL-1心脈隆膠囊溶液用無血清培養(yǎng)基稀釋），H2O2（試驗用62.5 μmol·L-1H2O2用生理鹽水稀釋），其他試劑均為國產(chǎn)分析純或進口分裝。

1.1.2 儀器 CO2培養(yǎng)箱（珠海市造鑫企業(yè)有限公司），智能型生物安全柜（上海智城分析儀器制造有限公司），倒置相差顯微鏡（日本尼康公司），細胞專用磨砂玻片（北京）。

1.1.3 主動脈 VSMCs培養(yǎng)主動脈VSMCs的原代培養(yǎng)采用組織貼塊法〔6〕進行。選用重量為180 g左右的雄性SD大鼠，用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，用酒精將大鼠全身擦拭消毒15 min，切開胸腹腔，無菌條件下分離全段主動脈，立刻放入含200 U·mL-1雙抗的D-Hank’s液中，用PBS漂洗2次，用彎鑷在含DHank’s液的培養(yǎng)皿中鈍性分離得到中膜，將中膜用手術(shù)刀切成1 mm×1 mm大小的組織塊，將切好的組織塊貼置50 mL的玻璃細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，組織塊間距0.5 cm，培養(yǎng)瓶內(nèi)加入2 mL含20%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，放入5%CO2的37℃的培養(yǎng)箱中，6 h后待組織塊牢固貼附于細胞瓶壁，再輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使組織塊完全浸沒于培養(yǎng)液中，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。細胞接種9 d后，可見組織塊從組織邊緣爬出，當單層細胞鋪滿近培養(yǎng)瓶底的80%以上時即可進行傳代。實驗所用的VSMCs為第五代。

1.2 方法

1.2.1 分組、細胞爬片 取第五代200 mL的VSMCs培養(yǎng)瓶1瓶，胰酶消化，離心，細胞重懸，細胞計數(shù)為1×105·mL-1，將細胞分為3組，正常組（ 含血清培養(yǎng)基+不含血清培養(yǎng)基+生理鹽水）、干預組（含血清培養(yǎng)基+不含血清培養(yǎng)基+62.5 μmol·L-1H2O2）、保護組（ 含血清培養(yǎng)基+200 μg·mL-1XMLJ+62.5 μmol·L-1H2O2），每組6片爬片，每塊爬片放入1 mL的細胞懸液，置60 mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，4 h后在培養(yǎng)皿中加入6 mL含血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，觀察待細胞鋪滿爬片后，正常組和干預組加入6 mL不含血清的DMEM/F12培養(yǎng)基， 保護組加入6 mL200 μg·mL-1的XMLJ，24 h后正常組加入6 mL生理鹽水，干預組和保護組各加入6 mL 62.5 μmol·L-1H2O2，均繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.2 HE染色 將細胞爬片從培養(yǎng)皿中取出，用PBS沖洗2遍，再用95%乙醇固定，進行HE染色，其中蘇木素染色15 min，伊紅染色5 min，酒精、二甲苯各洗脫3次。

1.2.3 倒置相差顯微鏡下及光鏡下觀察 對原代VSMCs的細胞形態(tài)觀察并進行拍照。將HE染色的爬片在光鏡下拍攝細胞形態(tài)。

2 結(jié)果

2.1 VSMCs原代培養(yǎng) 細胞接種9 d后，可見培養(yǎng)瓶底少數(shù)細胞自組織塊周圍游離出來（圖1），14 d后細胞生長迅速，呈典型的峰、谷樣生長，細胞形體多呈長梭形，核大，可見明顯的肌絲纖維（圖2）。

圖1 VSMCs從組織塊游離（ ×100）

圖2 原代VSMCs（ ×200）

2.2 HE染色 正常組VSMCs（ 圖3），胞漿豐富，胞質(zhì)密度高；干預組VSMCs（圖4），細胞連接緊密，核細胞質(zhì)濃密皺縮，肌絲成分減少；保護組VSMCs（圖5），脂質(zhì)胞漿皺縮程度明顯減輕，細胞核增大，細胞形態(tài)較接近于正常組細胞。

圖3 正常組VSMCs（ ×400）

圖4 干預組VSMCs（ ×400）

圖5 保護組VSMCs（ ×400）

3 討論

原代培養(yǎng)VSMCs主要有兩種方法：酶消化培養(yǎng)法和組織貼塊法。采用膠原酶消化培養(yǎng)法所需組織量較大，而且膠原酶價格昂貴，實驗成本較高，另外，酶消化法本身對細胞有毒性作用；采用組織塊貼塊法培養(yǎng)大鼠VSMCs更為簡便、經(jīng)濟、有效〔7〕。原代細胞從組織塊游離出來的時間常因為不同實驗室條件、組織塊多少等因素而有所不同。實驗中，原代細胞在培養(yǎng)第9 d游離出來，之后瓶內(nèi)的每塊組織塊均有VSMCs游離生長出來，由于VSMCs中混有部分成纖維細胞，實驗VSMCs是通過差時貼壁法純化的VSMCs。

AS的發(fā)生與多種因素有關，目前認為氧化應激、炎癥是AS發(fā)生和發(fā)展的核心機制〔8-9〕。氧化應激是過量的活性氧與內(nèi)源性清除活性氧的抗氧化系統(tǒng)間失去平衡，活性氧能介導血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞表型調(diào)節(jié)〔10〕。正常情況下，細胞具有平衡的抗氧化機制，但當某些因素作用于細胞使這一穩(wěn)態(tài)失調(diào)，活性氧產(chǎn)生的速率大于被清除的速率時，就會造成活性氧的蓄積，進而導致動脈血管的損傷。實驗中用62.5 μmol·L-1的過氧化氫對VSMCs產(chǎn)生氧化應激損傷作用，發(fā)現(xiàn)VSMCs形態(tài)明顯改變，而在200 μg·mL-1的XMLJ保護組， 氧化應激致使的細胞形態(tài)改變程度明顯減輕。只有當細胞形態(tài)保持穩(wěn)定，細胞本身才能發(fā)揮其平衡抗氧化機制，而這種抗氧化機制可能與基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）被突然激活有關〔11〕，因此XMLJ對VSMCs形態(tài)損傷保護作用的分子機制有待進一步研究。

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