王 燕，金 楊，劉振琪*

（1.大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000；2.大理州中醫(yī)醫(yī)院，云南大理 671000）

巖陀為虎耳草科植物西南鬼燈擎Rodgersia sambucifolia Hemsl.或羽葉鬼燈擎Rodgersia pinnata Hemsl.的干燥根莖〔1〕，具有收斂、消炎、祛風(fēng)除濕的功效，對(duì)菌痢、腸炎、感冒頭痛、外傷出血、風(fēng)濕骨痛、老年性支氣管炎等常見(jiàn)疾病有較好的療效〔2〕，在民間應(yīng)用廣泛。巖白菜素（bergenin）為巖陀的主要有效成分。巖白菜素有止咳作用，中國(guó)藥典收為鎮(zhèn)咳祛痰藥，用于慢性支氣管炎，文獻(xiàn)曾報(bào)道巖白菜素還有抗炎、抗?jié)儭⒆o(hù)肝、抗凝血、抗HIV病毒和提高免疫能力及鎮(zhèn)痛等作用〔3〕。因此進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用巖陀具有重要的社會(huì)價(jià)值。目前，對(duì)巖陀中巖白菜素的提取工藝缺乏系統(tǒng)研究，本文通過(guò)正交試驗(yàn)法對(duì)其提取工藝進(jìn)行探討〔4〕。

1 儀器與試藥

LC-20AD型HPLC系統(tǒng)，包括CTO-20AC柱溫箱、CBM-20A系統(tǒng)控制器、SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器、LC solution工作站（日本島津公司）；TU-1901型雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；XS205型梅特勒電子天平（上海亞榮生化儀器廠）；中藥材粉碎機(jī)（浙江溫嶺市林大機(jī)械有限公司）。所用藥材購(gòu)自云南大理，由貴州省藥品檢驗(yàn)所陳德媛研究員鑒定為真品；巖白菜素對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：1532-200202）；HPLC所用乙腈為色譜純，其它試劑為分析純，水為重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），檢測(cè)波長(zhǎng)為274 nm（ 對(duì)照品紫外光譜掃描圖見(jiàn)圖1），流速為1.0 mL·min-1，柱溫為30℃，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸（10∶90）。 理論塔板數(shù)按巖白菜素峰計(jì)不得少于4000。對(duì)照品及樣品色譜圖見(jiàn)圖2。

圖1 巖白菜素對(duì)照品的光譜掃描圖譜

圖2 巖陀中巖白菜素HPLC圖譜

2.2 對(duì)照品溶液的配置 精密稱取干燥至恒量的巖白菜素對(duì)照品11.36 mg，置于25 mL的量瓶中，加60%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得0.4544 mg·mL-1的巖白菜素對(duì)照品溶液。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取上述巖白菜素對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣2、4、6、8、10、12 μL，按上述色譜條件測(cè)定。以峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，巖白菜素進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=2×106X-86377（ r=0.9998）。 結(jié)果表明，巖白菜素進(jìn)樣量在0.9088～5.4528 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.4 供試品溶液的制備 合并所得濾液，揮干，殘?jiān)蛹状歼m量，溶解，全部轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，臨用前過(guò)0.45 μm濾膜。

2.5 巖白菜素含量測(cè)定〔5〕取上述對(duì)照品溶液和供試品溶液，注入高效液相色譜儀，各進(jìn)樣10 μL，用外標(biāo)法計(jì)算供試品溶液中巖白菜素的含量（mg·g-1），計(jì)算公式為：

巖白菜素的含量（ mg·g-1）=（ A供/A對(duì)）×C對(duì)×25/W

A對(duì)為對(duì)照品溶液峰面積積分值；A供為供試品溶液峰面積積分值；C對(duì)為對(duì)照品溶液濃度（mg·mL-1）；25為溶液稀釋倍數(shù)；W為供試品取樣量（g）。

2.6 提取方法的選擇 稱取巖陀細(xì)粉（過(guò)四號(hào)篩）0.5 g，平行3份，精密稱定，分別加20 mL甲醇，用冷浸提取法冷浸24 h；超聲提取法提取20 min；回流提取法提取40 min，濾過(guò)，按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件操作，各進(jìn)樣10 μL，測(cè)定巖白菜素含量。不同提取方法對(duì)巖白菜素含量的影響見(jiàn)表1。

表1 不同提取方法對(duì)巖白菜素含量的影響

由表1可知，采用超聲提取法得到的提取物巖白菜素含量最高，因此選擇超聲為提取方法。

2.7 提取溶劑的選擇〔6〕稱取巖陀細(xì)粉（過(guò)四號(hào)篩）0.5 g，平行4份，精密稱定，分別加20 mL的水、甲醇、乙醇和乙酸乙酯，用超聲提取法提取20 min，濾過(guò)，按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件操作，各進(jìn)樣10 μL，測(cè)定巖白菜素含量。不同提取溶劑對(duì)巖白菜素含量的影響見(jiàn)表2。

表2 不同提取溶劑對(duì)巖白菜素含量的影響

由表2可知，采用甲醇作為提取溶劑得到的提取物巖白菜素含量最高，因此選甲醇為提取溶劑。

2.8 正交試驗(yàn) 稱取巖陀細(xì)粉（過(guò)四號(hào)篩）0.5 g，平行9份，精密稱定，按L9（34）表下條件進(jìn)行提取，按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件操作，各進(jìn)樣10 μL，測(cè)定巖白菜素含量。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，選擇溶劑濃度（A），溶劑體積（B），提取時(shí)間（C）和提取次數(shù)（D）為考察因素，按正交設(shè)計(jì)表進(jìn)行試驗(yàn)。因素水平見(jiàn)表3，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4，方差試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

表3 因素水平表

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果

表5 方差分析結(jié)果

由表4、表5可知，4種因素對(duì)提取物巖白菜素含量的影響程度依次為C＞A＞D＞B，即提取時(shí)間＞溶劑濃度＞提取次數(shù)＞溶劑體積，提取時(shí)間、溶劑濃度、提取次數(shù)對(duì)提取物巖白菜素含量都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），溶劑體積對(duì)提取物巖白菜素含量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且其3個(gè)水平結(jié)果相差不大。為了使濾過(guò)等操作便于進(jìn)行，最終確定最佳提取工藝為A2B2C3D3，即用60%的甲醇20 mL，超聲提取3次，每次30 min。

2.9 驗(yàn)證試驗(yàn) 按正交試驗(yàn)結(jié)果，稱取巖陀細(xì)粉（過(guò)四號(hào)篩）0.5 g，平行6份，精密稱定，分別加60%的甲醇20 mL，超聲提取3次，每次30 min，濾過(guò)，按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件操作，各進(jìn)樣10 μL，測(cè)定巖白菜素含量。結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

由表6可知，優(yōu)化得到的工藝簡(jiǎn)便、易行，穩(wěn)定性好，重現(xiàn)性好，可為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用該藥材提供理論參考。

3 討論

超聲提取法操作簡(jiǎn)單、省時(shí)，最主要的是提取效果高。作為中藥提取的工藝之一，具有良好的應(yīng)用前景，且實(shí)驗(yàn)可在室溫下進(jìn)行，設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方便〔7〕，是提取巖陀中巖白菜素的一種有效方法。

在超聲條件下提取巖陀中巖白菜素時(shí)，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道〔3〕綜合分析得知超聲溫度和超聲功率對(duì)巖白菜素含量影響微弱，因此未把超聲溫度和超聲功率列入正交試驗(yàn)。通過(guò)正交試驗(yàn)結(jié)果可知，提取時(shí)間、溶劑濃度、提取次數(shù)是影響巖白菜素含量的主要因素，而溶劑體積對(duì)巖白菜素含量影響較小。本實(shí)驗(yàn)所優(yōu)化得到的巖陀中巖白菜素提取工藝簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、穩(wěn)定、可行。

〔1〕貴州省藥監(jiān)局.貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)〔S〕.貴陽(yáng)：貴州科技出版社，2003.

〔2〕史彥斌，胡振英，董鵬程，等.中草藥鬼燈檠的現(xiàn)代研究進(jìn)展〔J〕.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2004，15（ 9）：23-24.

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