施貴榮，莊孝龍，耿 玲，巫秀美，羅建蓉，劉光明

（大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000）

喙尾琵琶甲（ Blaps rynchopetera Fairmaire）屬鞘翅目（ Coleoptera）擬步甲科（ Tenebrionidae）琵琶甲屬（Blaps），是云南民間長期使用的昆蟲藥物，具有抗炎、抗菌、解毒等作用〔1〕。前期本課題組對喙尾琵琶甲乙醇提取物、水提取物、甲醇提取物進(jìn)行了體外抗菌作用的研究，發(fā)現(xiàn)喙尾琵琶甲具有良好的體外抗菌作用〔2-3〕；為了進(jìn)一步探討其抗菌作用部位，本課題組對喙尾琵琶甲的乙醇提取物進(jìn)行了硅膠柱柱層析，將得到的不同極性組分進(jìn)行體外抗菌活性篩選，確定喙尾琵琶甲的抗菌活性部位。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)藥材 樣品采集自大理市鳳儀鎮(zhèn)，經(jīng)毛本勇教授（大理學(xué)院農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院）鑒定為喙尾琵琶甲。

1.2 供試菌株 白色葡萄球菌（S.albus）、金黃色葡萄球菌（ S.aureas）、變形桿菌（ P.vulgaris）、枯草桿菌（ B.subtilis）、白色念珠菌（ C.albicans）、甲型副傷寒沙門菌（S.paratyphi A）。以上菌株均由大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 培養(yǎng)基 水解酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（簡稱M-H瓊脂培養(yǎng)基）（杭州天和微生物試劑有限公司，批號070731）；細(xì)菌干粉培養(yǎng)基（簡稱M-H肉湯培養(yǎng)基）（杭州天和微生物試劑有限公司，批號070905）；液體沙氏培養(yǎng)基（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號20090905）；沙氏瓊脂培養(yǎng)基（北京三藥科技開發(fā)公司，批號20091105）。

1.4 儀器 YXQ-LS-50S11型立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（ 瑞士BUCHI）；FD-1C-80冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樣品制備 取喙尾琵琶甲全蟲，干燥后粉碎，加5倍體積的95%乙醇回流提取3次，每次1 h，合并提取液濃縮回收乙醇，得乙醇提取物；取500 g浸膏用80目硅膠拌樣，干法上硅膠柱，用不同極性溶劑依次洗脫，濃縮得石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇五個(gè)組分；將6份樣品分別冷凍干燥低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 最低抑菌濃度的測定 采用常量試管稀釋法〔4-5〕測定喙尾琵琶甲提取物的最低抑菌濃度（MIC）。

2.2.1 菌液制備 從孵育10～12 h的非選擇性培養(yǎng)基上挑取3～5個(gè)菌落，直接用滅菌生理鹽水制成懸液并將濁度調(diào)至0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)，相當(dāng)于108CFU/mL的含菌量。 使用時(shí)用M-H肉湯稀釋（ 1∶10），稀釋后的菌液在15 min內(nèi)接種。

2.2.2 藥物稀釋 取已處理好的無菌試管（15 mm×100 mm）14支，排成一排，每管加入M-H肉湯2 mL；在第1管中加入部位提取物（100 mg/mL）2 mL，混勻后取出2 mL至第2管，再次混勻后再取出2 mL至第3管，如此連續(xù)對比稀釋至第11管，最后從第11管中取出2 mL棄去，保證每管終體積為2 mL。第11、12、13、14管分別為藥物不加菌液對照、M-H肉湯對照、菌液對照和溶劑對照。此時(shí)各管藥物濃度依次為50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.195、0.098 mg/mL。

2.2.3 抑菌實(shí)驗(yàn) 用M-H肉湯將調(diào)好的菌液作1∶10稀釋相當(dāng)于含菌液量大約為107CFU/mL，除第11、12、14管不加菌液外，其余每管加入菌液0.1 mL。置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～20 h后觀察結(jié)果。

2.2.4 結(jié)果判斷 在讀取試驗(yàn)結(jié)果前，先觀察生長對照管的細(xì)菌生長情況是否良好，并檢查接種物的傳代培養(yǎng)是否污染。然后以肉眼觀察藥物最低濃度管無細(xì)菌生長者則為該藥物的MIC。再用微量加樣器取出管中溶液100 μL密集劃線轉(zhuǎn)種于M-H瓊脂平板或沙氏瓊脂平板上，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，觀察無細(xì)菌生長或者細(xì)菌數(shù)小于5個(gè)的藥物最低濃度為最低殺菌濃度（ MBC）。

3 結(jié)果與討論

3.1 結(jié)果 由喙尾琵琶甲制備得到的6份樣品中，石油醚、氯仿、甲醇組分沒有體外抗菌作用，乙醇提取物、乙酸乙酯組分、丙酮組分對6種測試菌的MIC及MBC見表1～3。

表1 喙尾琵琶甲乙醇提取物對6種供試菌的MIC及MBC

表2 喙尾琵琶甲乙酸乙酯組分對6種供試菌的MIC及MBC

表3 喙尾琵琶甲丙酮組分對6種測試菌的MIC及MBC

由表1可看出，喙尾琵琶甲乙醇提取物對所選菌株有不同程度的抑菌作用，對白色葡萄球菌的作用最好，MIC為5.21 mg/mL；由表2可看出，乙酸乙酯組分對所選菌株也有不同程度的抑制作用，對白色葡萄球菌的作用最好，MIC為1.30 mg/mL，且乙酸乙酯組分的抑菌作用比乙醇提取物好；由表3可看出，丙酮組分除白色念珠菌外，對其他菌株都有不同程度的抑制作用，對白色葡萄球菌的作用最好，MIC為7.29 mg/mL。3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。

3.2 討論 目前，抗生素在臨床應(yīng)用最為廣泛，是人類防治感染性疾病最為重要的手段；但抗生素存在很多不良反應(yīng)的問題，同時(shí)細(xì)菌耐藥性會(huì)引發(fā)醫(yī)院感染增加，臨床療效下降，甚至?xí)霈F(xiàn)無藥可選現(xiàn)象；而中藥與抗生素相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：①具備非特異性抗菌作用并能調(diào)節(jié)及提高機(jī)體免疫力；②不良反應(yīng)小，在體內(nèi)藥物殘留量低；③較少細(xì)菌對中藥產(chǎn)生耐藥。因此，進(jìn)行天然藥物抗菌制劑開發(fā)是值得探索的研究方向，而我國的中醫(yī)文化和豐富的天然藥物資源為研究開發(fā)有效的抗菌制劑提供了最有利的保障〔6-7〕。

本研究通過體外抗菌實(shí)驗(yàn)，篩選出喙尾琵琶甲的抗菌活性部位。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出，喙尾琵琶甲乙醇提取物經(jīng)硅膠柱柱層析后，石油醚、氯仿、甲醇組分沒有體外抑菌作用，而乙醇提取物、乙酸乙酯組分、丙酮組分都對所測菌株有一定的抑制作用，其中乙酸乙酯組分的抑菌作用最強(qiáng)，說明分離過程將抗菌活性組分富集到了乙酸乙酯組分。由此可得出以下結(jié)論：通過硅膠柱柱層析除去了乙醇提取物中沒有抑菌作用的成分；乙酸乙酯組分的抑菌作用明顯強(qiáng)于丙酮組分，所以乙酸乙酯組分為喙尾琵琶甲的體外抗菌活性組分；喙尾琵琶甲提取物對白色葡萄球菌抑制作用最好。

（本次實(shí)驗(yàn)用的菌株由大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，謹(jǐn)致謝意。）

〔1〕張?zhí)m勝，夏從龍，楊永壽，等.彝藥喙尾琵琶甲的研究進(jìn)展〔J〕.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2009，20（ 12）：3113-3114.

〔2〕施貴榮，莊孝龍，孫會(huì)仙，等.喙尾琵琶甲抗菌活性的研究〔J〕.大理學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，9（ 12）：18-19.

〔3〕施貴榮，肖培云，洪小鳳，等.喙尾琵琶甲提取物體外抗菌作用初步研究〔J〕.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2011，22（ 3）：622-623.

〔4〕陳奇，卞如濂，陳修.中藥藥理研究方法學(xué)〔M〕.2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2006，274-277.

〔5〕馬緒榮，蘇德模.藥品微生物學(xué)檢驗(yàn)手冊〔M〕.北京：科學(xué)出版社，2001：210-212.

〔6〕陳勇川，謝林利，熊麗蓉，等.黃芩苷/黃芩素對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌抗藥性的逆轉(zhuǎn)作用研究〔J〕.中國藥房，2008，19（ 9）：644-646.

〔7〕楊玉琴，姚楚水，馬繼周.中藥皮膚消毒劑殺滅微生物效果的試驗(yàn)觀察〔J〕.中國消毒學(xué)雜志，2003，20（ 2）：92-94.