曹麗萍，賈睿，丁煒東，杜金梁，殷國俊

(中國水產(chǎn)科學研究院淡水漁業(yè)研究中心農業(yè)部水生動物遺傳育種和養(yǎng)殖生物學重點開放實驗室，江蘇無錫214081)

肝臟是魚體內最大的實質性器官，參與消化、代謝、排泄、解毒及免疫等多種生命活動，特別是胃腸吸收的物質幾乎全部進入肝臟，在肝臟內進行合成、分解、轉化和貯存，因此，魚類肝臟最易受多種病原體、毒物及免疫病理所累及［1-2］;同時環(huán)境污染，高蛋白、高脂肪或霉變飼料的使用，以及抗生素和殺蟲劑的濫用均可導致魚類肝膽疾病頻繁發(fā)生［3］。大量研究證實，在多種肝病的肝細胞損傷中，多種酶、自由基以及脂質過氧化反應均發(fā)生較大的變化，氧化應激是它們共同的損傷機制［4］。因此，利用具有生物學活性的肝損傷模型，快速而高通量地篩選護肝藥物并探索其作用原理具有重要意義。在人類及其他動物醫(yī)藥的研制與開發(fā)中，藥理模型的建立和應用發(fā)揮著積極的作用，但是在水產(chǎn)領域，魚類保肝藥物篩選模型的研究鮮有報道。

應用中草藥防治肝臟疾病有著悠久的歷史，很多研究表明，一些中草藥提取物及其化學成分對哺乳動物的肝臟具有保護作用［5-6］。近幾年來，水產(chǎn)領域有關保肝藥物方面的研究也證實，中草藥在抗魚類肝損傷時具有良好的效果和獨特的優(yōu)勢，且與其抗氧化和自由基活性有關［7-10］。具抗氧化活性的中草藥有望在不久的將來成為廣為利用的治療魚肝病的高效藥。

當歸Angelica sinesis(Oliv.)Diels.為傘形科、當歸屬植物的干燥根，主要活性成分為阿魏酸、當歸多糖和藁本內酯等［11］，其具有鎮(zhèn)痛、抗損傷、增強免疫以及抗氧化和清除自由基等作用［12］，是中國常用中藥［13］。當歸提取物對哺乳動物有較好的抗氧化作用，阿魏酸能通過直接消除自由基、抑制超氧自由基引起的膜脂質過氧化反應以及與生物膜磷脂結合，保護膜脂質等多種機理拮抗自由基對組織的損害［14］;當歸多糖則通過抑制丙二醛、一氧化氮的生成，減少谷胱甘肽的清除作用，拮抗四氯化碳 (CCl4)誘導的氧化性肝臟損傷，表現(xiàn)出抗氧化作用［15］。然而在水產(chǎn)領域關于當歸提取物的保肝和抗氧化作用研究卻少有報道。

本研究中，主要以 CCl4誘導建鯉 Cyprinus carpio var.Jian肝損傷，并建立急性肝損傷模型，通過檢測鯉血清和肝臟組織勻漿中相關生化指標的變化來評價當歸提取物對建鯉急性肝損傷的保護和抗氧化作用，旨在為進一步高通量篩選保肝中藥，開發(fā)魚類免疫調節(jié)和保肝中草藥配方奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑和儀器 CCl4(分析純)購于國藥集團化學試劑有限公司;谷丙轉氨酶 (GPT)、谷草轉氨酶 (GOT)、乳酸脫氫酶 (LDH)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽 (GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、總蛋白 (TP)、白蛋白 (Alb)和總抗氧化能力 (T-AOC)等測定試劑盒均購自于南京建成生物工程研究所科技有限公司;723分光光度計購自上海欣茂儀器有限公司。

1.1.2 試驗魚 建鯉采自中國水產(chǎn)科學院淡水漁業(yè)研究中心漁場，體質健康無傷，6月齡，體質量為150 g左右，飼養(yǎng)于循環(huán)水系統(tǒng)中，水溫為25℃，每天投喂商品飼料2次。

1.1.3 中草藥 當歸提取物 (Extract from Angelica sinennsis，EAS)購自南通四海植物提取有限公司。

1.2 方法

1.2.1 CCl4致建鯉肝損傷模型的建立 將健康建鯉隨機分為6組，每組20尾，投喂12 h后，稱重，按0.1 mL/10 g(體質量)劑量分別一次性腹腔注射 6.25%、12.50%、15.00%、18.75%和25.00%(體積分數(shù)，下同)的CCl4-橄欖油溶液，對照組注射等體積橄欖油溶液。觀察動物的存活情況，于造模后24～144 h取血，測定建鯉血清中GPT、GOT、LDH活性及MDA含量。如動物在試驗中死亡，則不進行測定。

1.2.2 CCl4致建鯉肝組織損傷及當歸提取物的保護試驗 將健康建鯉隨機分為4組，每組20尾，試驗設4組:空白對照組、模型對照組、低劑量EAS組和高劑量EAS組，其中兩對照組均飼喂基礎飼料，低劑量EAS組和高劑量EAS組分別飼喂含0.5%和1.0%EAS的飼料，各組均定時定量(投飼量為魚體質量的2%)投喂商品飼料，共飼養(yǎng)60 d。飼養(yǎng)結束后，除空白對照組腹腔注射橄欖油0.1 mL/10 g(體質量)外，其余各組均腹腔注射15.00%的CCl4-橄欖油溶液0.1 mL/10 g(體質量)，禁食，以誘導肝損傷。72 h后采血分離血清，測定各組血清中GPT、GOT、LDH活性及TP和Alb等含量;同時采集各組肝臟組織，制備勻漿，測定勻漿中SOD、MDA、T-AOC和GSH等生化指標。

1.2.3 肝組織勻漿的制備 將抽完血的魚進行解剖，在肝臟右中葉相同部位取肝臟組織，用預冷的生理鹽水漂洗血液，剪去肝臟表面附著的結締組織，再用濾紙吸去表面水分，稱重，用眼科剪刀剪碎，移入勻漿管中，加入9倍體積的生理鹽水(體積分數(shù)為0.86%)進行勻漿。該勻漿以2 000 r/min離心15 min，收集上清，備用。

1.3 指標的測定及數(shù)據(jù)分析

按照試劑盒說明書操作測定 GOT、GPT、LDH、MDA、SOD、GSH、T-AOC、Alb和 Tb等生化指標，試驗數(shù)據(jù)用平均值±標準誤差表示。采用SPSS 15軟件包中的單因素方差分析 (one-way-ANOVA)進行顯著性分析，用t檢驗對樣本之間進行比較。以P＜0.05和P＜0.01分別表示有顯著性和極顯著性差異。

2 結果

2.1 CCl4致建鯉肝損傷模型的建立

試驗組按0.1 mL/10 g(體質量)分別一次性腹腔注射6.25%、12.50%、15.00%、18.75%和25.00%的CCl4-橄欖油溶液，對照組注射等量橄欖油，24 h后，18.75%和25.00%的CCl4溶液造模組建鯉的死亡率分別為20%和50%，其它濃度的造模組和對照組均無死亡現(xiàn)象。6.25%、12.50%和15.00%的CCl4溶液造模組及對照組建鯉血清中GPT、GOT、LDH活性及MDA含量的測定結果見圖1～圖4。

2.1.1 注射不同濃度CCl4對建鯉血清GPT活性的影響 從圖1可見:與對照組相比，用12.50%和15.00%的CCl4溶液造模24 h均能引起建鯉血清中GPT活性極顯著性升高 (P＜0.01);兩造模組GPT活性在造模48 h最高，72 h次之，隨后迅速降低，第96 h后，GPT值恢復到接近正常水平。

圖1 CCl4濃度對建鯉血清中GPT活性的影響Fig.1 Effects of CCl4concentration on serum GPT activity in Jian common carp

2.1.2 注射不同濃度CCl4對建鯉血清GOT活性的影響 從圖2可見:與對照組相比，用12.50%和15.00%的CCl4溶液造模24 h均能引起建鯉血清中GOT活性顯著性升高 (P＜0.05)，均維持到造模后72 h，隨后迅速降低，第96 h后，GOT值恢復到接近正常水平。

圖2 CCl4濃度對建鯉血清中GOT活性的影響Fig.2 Effects of CCl4concentration on serum GOT activity in Jian common carp

2.1.3 注射不同濃度CCl4對建鯉血清LDH活性的影響 從圖3可見:與對照組相比，僅用15.00%的CCl4溶液造模48 h能引起建鯉血清中LDH活性顯著性升高 (P＜0.05)，維持到造模后72 h，隨后迅速降低，第96 h后，LDH值恢復到接近正常水平。

2.1.4 注射不同濃度CCl4對建鯉血清MDA含量的影響 從圖4可見:與對照組相比，用12.50%和15.00%的CCl4溶液造模24 h均能引起血清中MDA含量極顯著性升高 (P＜0.01);12.50%CCl4溶液造模組中MDA水平在造模第72 h恢復，而15.00%CCl4溶液造模組中MDA水平維持到第96 h，MDA值恢復到接近正常水平。

圖3 CCl4濃度對建鯉血清中LDH活性的影響Fig.3 Effects of CCl4concentration on serum LDH activity in Jian common carp

圖4 CCl4濃度對建鯉血清中MDA含量的影響Fig.4 Effects of CCl4concentration on serum MDA levels in Jian common carp

綜上所述，按0.1 mL/10 g(體質量)一次性腹腔注射15.00%的CCl4-橄欖油溶液作用72 h，比較合適構建建鯉的肝損傷模型。

2.2 當歸提取物的保護作用

2.2.1 EAS對CCl4致肝損傷的建鯉血清中GOT、GPT、LDH和SOD的影響 從圖5可見:與空白對照組相比，用15.00%的CCl4-橄欖油腹腔注射建鯉72 h后，鯉血清中的GOT、GPT和LDH活性極顯著性升高 (P＜0.01)，而SOD活性極顯著性下降 (P＜0.01);與模型對照組相比，0.5%和1.0%的EAS均能顯著抑制CCl4誘導的鯉血清中GOT、GPT和 LDH活性升高 (P＜0.01或 P＜0.05);同時0.5%的EAS對恢復血清中的SOD活性有顯著作用 (P＜0.05)。

2.2.2 EAS對CCl4肝損傷的建鯉血清中TP和Alb的影響 從圖6可見:與空白對照組相比，用15.00%的CCl4-橄欖油腹腔注射建鯉72 h后，鯉血清中的 TP和Alb含量極顯著性下降 (P＜0.01);與模型組相比，0.5%和1.0%的EAS均可以顯著恢復鯉血清中的TP和Alb含量 (P＜0.01或P＜0.05)。

圖5 當歸提取物對CCl4致肝損傷的建鯉血清中GPT、GOT、LDH和SOD活性的影響Fig.5 Effects of extract from Angelica sinennsis on the activities of GPT，GOT，LDH and SOD in hepatic-damaged Jian common carp

圖6 當歸提取物對CCl4致肝損傷的建鯉血清中總蛋白和白蛋白的影響Fig.6 Effects of extract from Angelica sinennsis on the serum total protein and albumin levels in the hepatic-damaged Jian common carp

2.2.3 EAS對CCl4肝損傷的建鯉肝組織勻漿中T-AOC、GSH、SOD和MDA的影響 從圖7可見:與空白對照組相比，用15.00%的CCl4-橄欖油腹腔注射建鯉72 h后，肝組織勻漿中的GSH、SOD活性及T-AOC水平極顯著性下降 (P＜0.01)，MDA含量顯著性升高 (P＜0.05);與模型對照組相比，0.5%的EAS能顯著促進組織中GSH、SOD活性及T-AOC水平恢復 (P＜0.01或P＜0.05)，同時顯著抑制 MDA合成 (P＜0.05);1.0%的EAS可以顯著提高勻漿中T-AOC水平和SOD活性 (P＜0.05)，但對GSH活性和MDA含量沒有明顯影響 (P＞0.05)。

3 討論

3.1 CCl4致建鯉肝損傷模型的建立

CCl4是一種經(jīng)典的肝臟毒物，被廣泛用于構建肝 (細胞)損傷模型以篩選保肝藥物［16］。CCl4可通過細胞色素P450作用分解為三氯甲烷自由基(CCl3·)［17］，CCl3·既能選擇性地損傷肝小葉中央?yún)^(qū)的細胞，又能迅速與O2結合轉化為過氧化三氯甲烷自由基(CCl3O2·)［18］，這些自由基通過攻擊肝細胞膜上磷脂分子引起脂質過氧化，損傷肝細胞;同時CCl4能抑制內源性抗氧化酶(如SOD)活性，致使大量自由基無法清除，加重脂質過氧化［19］，而MDA是脂質過氧化的主要降解產(chǎn)物［20］，可嚴重損傷肝細胞結構，導致肝細胞壞死，進一步加重肝細胞的損傷，并阻斷膜蛋白的合成，使胞漿內的可溶性酶滲出，導致血清中 GOT、GPT和LDH活性上升［21-22］。據(jù)此，本研究中選擇血清中GOT、GPT、LDH、SOD、MDA及相關輔助性生化指標等來確定CCl4致建鯉肝損傷模型所需濃度及時間，并以此評價當歸提取物的保肝和抗氧化作用。

構建急性肝損傷模型來篩選保肝藥物，關鍵是造模濃度的選擇，既要求肝損傷指標明顯，又要求高存活率。濃度過小，損傷輕，指標變化不明顯，不利于分析保肝藥藥效;濃度過大，容易引起肝功能衰竭，導致死亡率增加，造成藥品和動物的浪費且不利于統(tǒng)計分析［23］。本試驗在造模過程中，不僅要探索CCl4造模的劑量，還要考慮到最終的注射劑量，依據(jù)魚體質量決定的注射劑量一次性給予太多會導致溶液泄漏，造成劑量不精準;另外，本研究中還發(fā)現(xiàn)，采用腹腔注射法來造模，能有效減少由于操作失誤導致的魚體死亡。通過測定血清中GOT、GPT、LDH和MDA等生化指標，確定CCl4致建鯉肝損傷模型的最佳濃度及時間:15.00%CCl4溶液，0.1 mL/10 g(體質量)，腹腔注射作用72 h。該急性肝損傷模型具有以下特點:一次性給藥，劑量精準，操作簡單;肝損傷指標明確;周期短，建鯉全部存活。

3.2 當歸提取物的保護作用

CCl4在體內形成的自由基 (CCl3·)可促使細胞膜上不飽和脂肪酸分解，最終導致細胞膜破壞，GOT、GPT和LDH逸出，使其在血液中的含量升高［24］。GOT和GPT是反映線粒體膜損傷和肝細胞損傷的重要指標。本試驗結果顯示，0.5%和1.0%的中藥均能顯著抑制 CCl4誘導的血清中GOT、GPT和LDH升高，說明EAS能抵抗磷脂氧化，保護生物膜。當歸提取物的兩種主要活性成分——當歸多糖和阿魏酸鈉對大鼠和小鼠保肝作用的研究也表明，EAS有保護細胞膜完整性的作用［25-26］。

SOD是動物機體內的抗氧化酶，能清除自由基，防止自由基對細胞結構的損傷，其活力的大小反映了機體抗氧化、清除自由基的能力［17，27-28］。GSH是一種生物體內最豐富的三肽非酶類抗氧化劑［29-31］，可直接消除活性氧自由基，同時作為谷胱甘肽過氧化物酶的底物，在清除細胞內過氧化氫及脂過氧化物中發(fā)揮作用，GSH的多少是衡量機體抗氧化能力大小的重要因素［32］。MDA是細胞膜脂質過氧化反應的終產(chǎn)物，細胞中MDA含量多少可反映細胞脂質過氧化的損傷程度［20］。當歸的清除自由基和抗脂質過氧化作用已在哺乳動物上做過大量的試驗研究。曾國華等［33］在研究用阿魏酸鈉預處理對大鼠心肌細胞缺氧/復氧損傷的延遲保護作用時發(fā)現(xiàn)，其有強大的抗自由基損傷的作用，主要表現(xiàn)為增加SOD、GSH-Px活性，減少MDA含量。袁新初等［34］的報道也證實，當歸注射液的清除自由基和抗脂質過氧化作用能有效保護更年期大鼠。本研究中也得出了一致的結論，0.5%、1.0%的EAS對恢復肝損傷建鯉血清和肝臟組織中SOD、GSH含量有顯著效果;0.5%的EAS能顯著抑制MDA合成。由此可推測，EAS對CCl4誘導的建鯉肝組織損傷的保護作用應與其清除自由基能力和還原能力有關，EAS能較好地恢復SOD酶活性，減少MDA的生成及還原性GSH的消耗，從而增強機體的抗氧化能力。

本研究中以CCl4為損傷劑成功建立了建鯉肝損傷模型，并研究了EAS對急性肝損傷的保護作用，結果顯示，EAS能通過提高GSH和SOD酶活力以及抑制脂質過氧化產(chǎn)物MDA的生成來減輕CCl4對肝的損傷，減少 GPT、GOT和 LDH的釋放，對CCl4造成的肝急性損傷具有一定的保護作用，且該保護作用可能與其抗氧化、清除自由基能力有關，這將為進一步了解EAS對損傷肝細胞保護的藥理作用機制及篩選更多的中草藥提供了基礎資料。

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