劉利利

隨著圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)的進(jìn)步，早產(chǎn)兒腦損傷日益成為近年來(lái)國(guó)內(nèi)外圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)和新生兒學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。研究報(bào)道，早產(chǎn)兒這種神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙主要由腦白質(zhì)損傷所致[1]。最近研究表明，眾多細(xì)胞因子參與早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷的發(fā)病過(guò)程。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞因子，其在早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷中的作用日益受到關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)建立3日齡大鼠缺氧缺血性腦損傷模型，通過(guò)測(cè)定其后不同時(shí)間點(diǎn)腦白質(zhì)區(qū)VEGF蛋白質(zhì)的表達(dá)，探討其在3日齡未成熟大鼠缺氧缺血后的表達(dá)變化規(guī)律，進(jìn)一步闡明VEGF在早產(chǎn)兒腦損傷發(fā)病機(jī)理中的作用，以期為早產(chǎn)兒腦損傷的防治開(kāi)辟新的途徑，為臨床的進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供客觀實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 92只3日 齡(出 生 日 為0天)SD(Sprague-Dawley)大鼠，雌雄不限，體重6.5～10.5 g。隨機(jī)分為缺氧缺血模型組(以下簡(jiǎn)稱(chēng)實(shí)驗(yàn)組)50只和假手術(shù)組(以下簡(jiǎn)稱(chēng)對(duì)照組)42只，各組間雌雄、體重比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。術(shù)前稱(chēng)重及編號(hào)，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物用無(wú)水乙醚吸入麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，碘伏消毒手術(shù)區(qū)，緊貼氣管右側(cè)做一約1 cm縱切口，切開(kāi)皮膚及皮下組織，分離肌層，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈，并用9-0絲線結(jié)扎，縫合傷口，再次消毒，表皮滴少量青霉素注射液。手術(shù)于5 min內(nèi)完成。術(shù)后讓實(shí)驗(yàn)鼠于37 ℃水浴箱中恢復(fù)2 h，后置于透明密封箱內(nèi)，輸入含氧氣6%、氮?dú)?4%的混合氣體，氣體流量1.5 L/min，測(cè)氧儀監(jiān)測(cè)得箱內(nèi)O2濃度為6%，4 h后取出，放回原飼養(yǎng)環(huán)境中繼續(xù)母乳喂養(yǎng)。對(duì)照組同樣分離頸總動(dòng)脈，然后僅將手術(shù)線從右側(cè)頸總動(dòng)脈穿過(guò)而不予以結(jié)扎，也不予以缺氧處理。整個(gè)手術(shù)及缺氧過(guò)程中，保持周?chē)h(huán)境溫度為30 ℃以上。實(shí)驗(yàn)組有10只大鼠因不能耐受手術(shù)，分別在手術(shù)中和手術(shù)后死亡。對(duì)照組有2只不明原因死亡。兩組大鼠共80只(實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各40只)分別于缺氧缺血后12、24、48、72 h及7 d處死(每組各時(shí)間點(diǎn)8只)。

1.2 取材及切片制備

1.2.1 取材 大鼠乙醚吸入麻醉后，開(kāi)胸暴露心臟，經(jīng)左心室灌注肝素化0.9%生理鹽水20 ml，同時(shí)在右心耳處剪一切口，至流出液體變清為止。繼予以4%冰多聚甲醛30 ml灌注，至肝臟明顯變白及肺臟明顯水腫、四肢完全僵直后，美藍(lán)標(biāo)記前囟位置，立即開(kāi)顱取腦組織，將標(biāo)本于4%冰多聚甲醛固定12 h，將固定的鼠腦從前囟后以視交叉為中心前后3 mm取材，再固定24 h。

1.2.2 切片制備 標(biāo)本組織塊經(jīng)梯度脫水、浸蠟、包埋。包埋后的組織蠟塊連續(xù)切片，厚度為3 μm，每塊組織取連續(xù)切片2張(1張HE染色，1張免疫組化)，分別裱于經(jīng)APES處理的載玻片上，做免疫組化染色。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色法(SABC法)檢測(cè)腦組織內(nèi)VEGF的表達(dá)。

1.3 陽(yáng)性結(jié)果的判定及計(jì)數(shù)方法 (1)陽(yáng)性細(xì)胞的判斷：VEGF顯色主要在胞漿，有明確棕色或棕黃色染色為陽(yáng)性細(xì)胞；iNOS顯色定位于細(xì)胞漿/膜，有棕黃色染色為陽(yáng)性細(xì)胞；(2)陽(yáng)性細(xì)胞分級(jí)及計(jì)數(shù)方法：通過(guò)計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞的比例和細(xì)胞染色強(qiáng)度，半定量評(píng)定VEGF及iNOS蛋白的表達(dá)。①根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占的比例分為3個(gè)等級(jí)。1級(jí)：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%；2級(jí)：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)10%～50%；3級(jí)：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>50%。②根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞的染色強(qiáng)度分為5個(gè)等級(jí)。1級(jí)：陰性或微弱染色；2級(jí)：≤50%陽(yáng)性細(xì)胞中等強(qiáng)度染色；3級(jí)：>50%陽(yáng)性細(xì)胞中等強(qiáng)度染色；4級(jí)：≤50%陽(yáng)性細(xì)胞高強(qiáng)度染色；5級(jí)：>50%陽(yáng)性細(xì)胞高強(qiáng)度染色。

每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各觀察8只大鼠，每只大鼠取相鄰切片2張，每張切片于右側(cè)腦室周?chē)踪|(zhì)和胼胝體區(qū)，各觀察3個(gè)不重疊的高倍視野(10×40)，取這3個(gè)視野細(xì)胞染色強(qiáng)度的等級(jí)平均值與陽(yáng)性細(xì)胞比例等級(jí)數(shù)相乘，結(jié)果用任意單位(arbitraryunits，AU)值表示[2]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以(±s)表示，表示成組設(shè)計(jì)的兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way-ANOVA)，兩兩比較，方差齊者用LSD法，方差不齊者用Duttet′T3法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

各組大鼠腦組織均可見(jiàn)VEGF蛋白的少量表達(dá)，免疫陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色表達(dá)于細(xì)胞漿中，細(xì)胞核為淺藍(lán)色。VEGF在腦組織中呈廣泛表達(dá)，主要見(jiàn)于胼胝體區(qū)、腦室周?chē)踪|(zhì)的膠質(zhì)細(xì)胞、海馬、皮質(zhì)區(qū)的神經(jīng)元、內(nèi)皮細(xì)胞、軟腦膜細(xì)胞等。對(duì)照組胼胝體和腦室周?chē)踪|(zhì)VEGF的表達(dá)較弱，且隨日齡的增加表達(dá)沒(méi)有明顯變化，組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)組VEGF陽(yáng)性細(xì)胞在腦室周?chē)踪|(zhì)和胼胝體區(qū)反應(yīng)性增加，于缺氧缺血12 h表達(dá)開(kāi)始增加，24 h表達(dá)達(dá)到高峰，7 d時(shí)恢復(fù)至正常，組間各時(shí)間點(diǎn)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組胼胝體、腦室周?chē)踪|(zhì)VEGF的表達(dá)在12、24、48、72 h與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，7 d與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。HI對(duì)側(cè)亦有VEGF陽(yáng)性細(xì)胞，但明顯少于缺血側(cè)。見(jiàn)表1、2。

表1 腦室周?chē)踪|(zhì)VEGF表達(dá)(AU值)(±s)

表1 腦室周?chē)踪|(zhì)VEGF表達(dá)(AU值)(±s)

注:實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)間兩兩比較，P<0.05，F(xiàn)=36.88

組別 12 h 24 h 48 h 72 h 7 d對(duì)照組 (n=40) 2.71±0.79 2.88±0.99 2.63±0.95 2.63±0.92 2.83±0.82實(shí)驗(yàn)組 (n=40) 5.67±0.80 12.0±2.14 9.0±2.14 7.29±1.16 3.13±1.04 t值 7.47 10.95 7.71 8.93 0.62 P值 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 >0.05

表2 胼胝體區(qū)VEGF表達(dá)(AU值)(±s)

表2 胼胝體區(qū)VEGF表達(dá)(AU值)(±s)

注：驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)間兩兩比較，P<0.05，F(xiàn)=43.28

組別 12 h 24 h 48 h 72 h 7 d對(duì)照組 (n=40) 2.71±0.79 2.92±1.05 2.71±0.98 2.54±0.85 2.67±1.01實(shí)驗(yàn)組 (n=40) 5.33±1.13 12.50±1.41 8.75±2.25 6.92±0.85 3.88±1.33 t值 5.40 15.39 6.96 10.27 1.55 P值 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 >0.05

3 討論

隨著圍產(chǎn)保健及對(duì)宮內(nèi)感染認(rèn)識(shí)的重視，現(xiàn)臨床所見(jiàn)宮內(nèi)感染造成的腦白質(zhì)損傷病例已逐漸下降。因此，缺氧缺血成為早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷的主要原因。缺氧缺血后，機(jī)體所誘發(fā)的一系列病理生理過(guò)程是諸多因素共同作用的結(jié)果。近年來(lái)，各種細(xì)胞因子的研究受到關(guān)注并取得較大進(jìn)展。其中VEGF作為一種腦保護(hù)因子，其作用亦顯重要。VEGF是Ferrara等[3]1989年首先從牛垂體的濾泡星狀細(xì)胞中純化出的同源二聚體糖蛋白。其分子量40～45 KD，耐酸、耐熱，等電點(diǎn)>7.5。人VEGF基因位于6號(hào)染色體Gp21.3，全長(zhǎng)14 kb，包括8個(gè)外顯子、7個(gè)內(nèi)含子，至少以6種亞型存在，分別為VEGF-A(VEGF165)、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E及胎盤(pán)生長(zhǎng)因子(PIGF)。在正常成人和動(dòng)物組織中水平很低，而在某些病理情況下，如缺血、缺氧時(shí)，VEGF表達(dá)明顯增加，尤以腦組織中VEGF表達(dá)升高明顯[4]。VEGF是內(nèi)皮細(xì)胞的強(qiáng)力絲裂劑，具有強(qiáng)大促進(jìn)新血管生成作用，是最具特異性且作用最強(qiáng)的內(nèi)源性血管生成因子。VEGF需與存在于內(nèi)皮細(xì)胞表面的特異性受體(Flt-1，F(xiàn)lk-1/KDR)結(jié)合，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，刺激體內(nèi)新生血管生成。關(guān)于VEGF在未成熟大鼠缺氧缺血性腦白質(zhì)損傷的表達(dá)變化，國(guó)內(nèi)外少見(jiàn)報(bào)道。

在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，各組大鼠腦組織均可見(jiàn)VEGF蛋白的少量表達(dá)，免疫陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色表達(dá)于細(xì)胞漿中，細(xì)胞核為淺藍(lán)色。VEGF在腦組織中呈廣泛表達(dá)，主要見(jiàn)于胼胝體區(qū)、腦室周?chē)踪|(zhì)的膠質(zhì)細(xì)胞、海馬、皮質(zhì)區(qū)的神經(jīng)元、內(nèi)皮細(xì)胞、軟腦膜細(xì)胞等。VEGF于缺氧缺血12 h表達(dá)開(kāi)始增加，缺氧缺血24 h表達(dá)達(dá)到高峰，缺氧缺血72 h仍有表達(dá)，7 d時(shí)恢復(fù)至正常。該結(jié)果考慮與HI腦組織通過(guò)VEGF表達(dá)促進(jìn)血液再灌注及供氧量的增加，促進(jìn)腦白質(zhì)少突膠質(zhì)細(xì)胞生理功能的恢復(fù)有關(guān)。其表達(dá)呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(shì)，這一結(jié)果與國(guó)外和國(guó)內(nèi)一些研究一致。Ogunshola等[5]將新生大鼠出生后置于含90.5%氮?dú)饧?.5%氧氣的缺氧條件下，發(fā)現(xiàn)VEGF蛋白在生后第8天表達(dá)明顯增加，并持續(xù)至生后33 d，說(shuō)明缺氧可誘導(dǎo)VEGF蛋白的表達(dá)。國(guó)內(nèi)秦元華等[6]研究VEGF在7日齡SD大鼠HIBD后腦組織中的表達(dá)變化得出，VEGF在模型后即刻即有表達(dá)，12 h達(dá)到高峰，隨后下降，7 d后呈低水平表達(dá)，說(shuō)明大腦缺氧缺血會(huì)產(chǎn)生VEGF的高表達(dá)，且隨時(shí)間波動(dòng)。其結(jié)果的差異可能與動(dòng)物模型、動(dòng)物日齡不同、缺氧時(shí)間及濃度不同等有關(guān)。

在實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組大鼠VEGF的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，且缺氧缺血側(cè)腦白質(zhì)VEGF的表達(dá)明顯高于對(duì)側(cè)。這一發(fā)現(xiàn)也與國(guó)外及國(guó)內(nèi)研究一致。國(guó)外Lennmyr等[7]發(fā)現(xiàn)，在腦缺血缺氧后，神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞VEGF的表達(dá)增強(qiáng)。國(guó)內(nèi)于慕剛等[8]觀察7日齡大鼠HI后不同時(shí)間點(diǎn)VEGF和新生血管的表達(dá)，得出結(jié)論為，HI可誘導(dǎo)VEGF表達(dá)增加，VEGF參與了HI后腦組織新生血管的形成。

本實(shí)驗(yàn)表明，3日齡大鼠腦缺氧缺血可誘導(dǎo)腦白質(zhì)內(nèi)源性VEGF的表達(dá)增強(qiáng)，這可能是機(jī)體對(duì)抗缺血所引起的腦白質(zhì)損害的一種自身保護(hù)方式。但機(jī)體的這種反應(yīng)尚不足以促進(jìn)腦缺氧缺血后的神經(jīng)功能康復(fù)，適時(shí)地激活內(nèi)源性VEGF表達(dá)或應(yīng)用外源性VEGF，充分發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)、神經(jīng)再生及血管再生的作用，可能為早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷的治療提供廣闊的前景。本結(jié)果為以后開(kāi)展VEGF干預(yù)治療打下了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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