涂永勤，朱華李，張德利，陳仕江

（重慶市中藥研究院，重慶 400065）

冬蟲夏草Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.，又名蟲草，系麥角菌科蟲草屬真菌中國被毛孢寄生蝠蛾屬昆蟲幼蟲體內(nèi)形成的蟲菌復(fù)合體，是我國特有珍稀名貴中藥材。具有補肺益腎、止咳化痰，主治咳嗽、咳血、陽痿遺精、病后體虛、老年慢性咳嗽等疾病[1]。冬蟲夏草主產(chǎn)于我國西藏、青海、云南、四川和甘肅等省區(qū)海拔3 500 m~5 200 m局部高寒山區(qū)草甸地帶，天然資源十分有限。近年來，由于價格上漲，過度采挖，加之生態(tài)環(huán)境的惡化，天然資源日趨枯竭。因此，人工栽培冬蟲夏草勢在必行。冬蟲夏草菌能否感染寄主昆蟲是冬蟲夏草人工培殖的幾個關(guān)鍵技術(shù)之一。有關(guān)冬蟲夏草侵染寄主幼蟲的技術(shù)雖然已有大量的研究[2-6]，但感染率普遍較低，除接種方法外，與不同菌株的侵染力有一定關(guān)系。本試驗研究不同菌株對蝙蝠蛾幼蟲感染能力的一些基本規(guī)律進行探索。在此方面，國內(nèi)外尚未見有研究報道。現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 蟲種

小金蝠蛾Hepialus xiaojinensis Tu et Ma，采自四川阿壩藏族羌族自治州小金縣崇德鄉(xiāng)崇德牧場；貢嘎蝠蛾H.gonggaensis Fu et Huang，采自四川甘孜藏族自治州康定縣老榆林鄉(xiāng)雅家?。槐热珧鸲闔.biruensis Fu.Sp.nov，采自西藏那曲地區(qū)比如縣恰則鄉(xiāng)；劍川蝠蛾H.jianchuanensis Yang，引自云南省劍川縣老君山；石渠蝠蛾H.sp.采自四川省甘孜藏族自治州石渠縣德榮瑪鄉(xiāng)。

1.1.2 菌種

采自全國主要冬蟲夏草產(chǎn)區(qū)，即四川理塘、雅江、石渠、白玉、康定沙德、康定雅家埂、青海玉樹、雜多縣、西藏比如、丁青、云南德欽縣白馬雪山、劍川縣老君山等地的天然冬蟲夏草，經(jīng)分離純化、培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化為具有侵染能力的菌體形態(tài)（分生孢子）備用。

1.1.3 試驗儀器、器具和試劑

BH2P Olympus生物研究顯微鏡，日本產(chǎn)；JSZ6S型體視鏡，南京江南永新光學(xué)有限公司生產(chǎn)；LRH-250型光照恒溫箱，上海產(chǎn)躍進醫(yī)療器械有限公司；SPX-250型生化培養(yǎng)箱，上海產(chǎn)躍進醫(yī)療器械有限公司；養(yǎng)蟲盒、基質(zhì)、飼料植物珠芽蓼、酒精及“84”消毒液等。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同產(chǎn)地冬蟲夏草菌感染寄主昆蟲試驗

將不同產(chǎn)地冬蟲夏草菌株經(jīng)分離純化、培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化而得的孢子懸浮液，進行接菌感染試驗。每處理用30頭幼蟲，重復(fù)3次。于接菌6個月后，挑取幼蟲血淋巴，在顯微鏡下，觀察幼蟲感菌情況。

1.2.2 冬蟲夏草菌感染不同寄主幼蟲試驗

選用全國主要冬蟲夏草產(chǎn)區(qū)寄主昆蟲5個種進行感染試驗，每處理30頭幼蟲，重復(fù)3次。于接種6個月左右時間，顯微鏡檢查幼蟲感染情況。

1.2.3 不同產(chǎn)地冬蟲夏草差異比較

觀察不同產(chǎn)地冬蟲夏草子座、子囊殼及子囊孢子形態(tài)及色澤的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 寄主幼蟲感染的檢查

接種幼蟲經(jīng)過6個月左右后，挑去幼蟲血淋巴，用顯微鏡檢查幼蟲感染情況。結(jié)果表明,在顯微鏡下，感染幼蟲血淋巴內(nèi)可以見到大量密集、形態(tài)相似、長寬相近的菌絲段或分生孢子（圖1、圖2）。這些菌體，經(jīng)交結(jié)成菌核，萌發(fā)產(chǎn)生子座（Stroma），并最終形成冬蟲夏草（Cordyceps sinensis） 藥材[7]。

圖1 冬蟲夏草菌分生孢子（高倍）

圖2 冬蟲夏草菌分生孢子（低倍）

2.2 不同菌株感染寄主幼蟲

用冬蟲夏草菌的不同菌株對寄主幼蟲（小金蝠蛾）接種，感染實驗結(jié)果見表1。

由表1可知，除老君山蟲草菌不能侵染寄主幼蟲外，其他菌株都能不同程度地侵染小金蝠蛾，但侵染力有差異。小金蟲草菌菌株最高感染率為72.22%，西藏比如蟲草菌株感染率最低為45.56%。

2.3 不同寄主蝠蛾幼蟲感染冬蟲夏草菌

表1 不同菌株感染寄主幼蟲情況

不同種類寄主蝠蛾幼蟲感染冬蟲夏草菌的實驗結(jié)果見表2。

表2 不同寄主昆蟲感染情況

從表2可以看出，冬蟲夏草菌（康定沙德菌株）除不能侵染劍川蝠蛾外，對其他蟲草蝠蛾均能侵染。但對不同種寄主幼蟲的侵染力有差異。貢嘎蝠蛾感染率最高為75.56%，比如蝠蛾感染率最低為58.89%。劍川蝠蛾不能感染冬蟲夏草菌，而老君山蟲草菌亦不能侵染其他蟲草蝠蛾，說明兩者可能為不同的種，這也證明了陳吉岳等[8]的研究。

2.4 冬蟲夏草菌菌株間的比較

冬蟲夏草菌菌株內(nèi)或菌株間子實體在色澤上有一定的變化，由灰（枯）黃色、深褐色到黑色的變化，老君山蟲草無色澤變化，為棕黃色或棕色。冬蟲夏草各菌株多生長在高山草甸土中，而老君山蟲草多在林下與苔蘚混生。老君山蟲草的子座纖細(xì)很長，棕色，產(chǎn)孢部分短，子囊殼較大，排列不規(guī)則（圖3）；而冬蟲夏草的子座一般較短且粗，呈長圓錐體狀，產(chǎn)孢部分比較長，差不多占到了子座的一大半，子囊殼較小，排列緊密規(guī)則（圖4）。在顯微鏡下，老君山蟲草的子囊孢子細(xì)長（圖5），冬蟲夏草菌的子囊孢子相對較粗短（圖6）。不同產(chǎn)地冬蟲夏草菌在子囊孢子形態(tài)上沒有差別。

3 討論與結(jié)論

圖3 老君山蟲草子座及產(chǎn)孢器

圖4 冬蟲夏草子座及產(chǎn)孢器

圖5 老君山蟲草子囊孢子

圖6 冬蟲夏草子囊孢子

寄主幼蟲感染冬蟲夏草菌是冬蟲夏草人工培殖的關(guān)鍵技術(shù)之一。現(xiàn)有研究表明中國被毛孢[9,10]是冬蟲夏草菌的無性型。目前，冬蟲夏草菌侵染寄主蝠蛾的機理尚不清楚。有人從冬蟲夏草子實體中分離無性型時，除分離出中國被毛孢 （Cordyceps sinensis） 外，還分離到中國擬青霉（Paecilomyces sinensis Chert,Xiao＆Shi）、中國金孢霉（Chrysosporium sinense Liang） 和蟲生簇孢 （Sporothrix insectorumde Hong＆Evans）等多種真菌。用分子生物學(xué)方法證明，在子座成熟過程中，中國被毛孢和蝙蝠蛾擬青霉有DNA共存和競爭增殖[11-13]。所以，認(rèn)為冬蟲夏草菌侵染寄主幼蟲是冬蟲夏草菌與蝙蝠蛾擬青霉等菌的復(fù)合侵染。但是，本研究用經(jīng)純化的冬蟲夏草菌孢子液為菌種，且基質(zhì)、飼料都經(jīng)過嚴(yán)格消毒處理，冬蟲夏草菌仍然能使蝠蛾幼蟲感染成功，獲得了冬蟲夏草藥材。重要的是在人工飼養(yǎng)蝠蛾幼蟲中，蝠蛾幼蟲一旦被蝙蝠蛾擬青霉菌侵染，無論蟲體打小，幼蟲最早10 d左右死亡，最晚在1個月內(nèi)全部死亡，死亡蟲體內(nèi)被擬青霉菌所充滿，大量孢梗束伸出，頂端產(chǎn)生大量近球形的分生孢子。如果侵染有擬青霉菌參與，就不大可能長成冬蟲夏草藥材。由此證明冬蟲夏草菌侵染寄主幼蟲，應(yīng)該是由冬蟲夏草菌單一侵染的結(jié)果，而非與其他菌的復(fù)合侵染。有關(guān)冬蟲夏草菌侵染寄主幼蟲的過程及機理有待深入研究。

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