江玉姬，謝寶貴，劉新銳，鄧優(yōu)錦，陳東興，朱 堅(jiān)

（1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心，福建 福州 350002；3.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002）

巨大革耳（Panus giganteus） 又名大杯傘、大杯蕈、大漏斗菌、豬肚菇、筍菇、大杯香菇等，隸屬真擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、擔(dān)子菌綱 （Basidiomycetes）、多孔菌目（Polyporales）、多孔菌科（Polyporaceae）、革耳屬 （Panus）[1]。自然環(huán)境中夏、秋季節(jié)大量群生或叢生于林地腐枝層上，主要分布在我國的河北、山西、黑龍江、青海等地區(qū)。從自然界的生長習(xí)性和分布可以看出，巨大革耳（豬肚菇）是一種中高溫型的美味珍稀食用菌種類，菌肉肥厚，個(gè)體較大，味道鮮美，是一種很有發(fā)展前途的夏、秋季栽培食用菌[2]。人工栽培多進(jìn)行熟料袋栽，栽培方法與常規(guī)木腐生菌相同。但巨大革耳（豬肚菇）人工栽培歷史很短，目前栽培用種主要來源于野生資源的馴化和引種，存在著同種異名，同名異種的現(xiàn)象，給生產(chǎn)和育種帶來了混亂產(chǎn)生了嚴(yán)重的后果。本文應(yīng)用ISSR分子標(biāo)記對國內(nèi)不同地區(qū)收集或分離的9株巨大革耳進(jìn)行了分子遺傳多樣性研究，為巨大革耳菌種管理、遺傳資源的保護(hù)和充分利用、育種研究工作的開展等提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌種

9株供試菌株，由福建食用菌株，質(zhì)資源保藏管理中心提供，試驗(yàn)編號及其它信息如表1所示。

1.1.2 試劑

20個(gè)ISSR引物為上海Sangon生物工程公司生產(chǎn)；PCR kit、500 bp DNA Ladder Marker購自 TaKaRa公司，其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 供試培養(yǎng)基

斜面固體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，水1 000 mL，pH值自然。

液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g，水1 000mL，pH值自然。

表1 供試巨大革耳菌株及來源

出菇培養(yǎng)基：棉籽殼85%、麥麩10%、玉米粉3%、碳酸鈣或石膏2%，含水量65%～70%，pH6.0。

1.1.4 巨大革耳菌絲體制備

供試菌株在PDA試管斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d～10 d后，轉(zhuǎn)接到新鮮PDA試管斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)至滿管，用接種耙耙碎菌塊，接入250 mL三角瓶液體培養(yǎng)基中，每個(gè)菌株各接2瓶，置于120 r·min-1搖床上26℃恒溫培養(yǎng)10 d，用紗布過濾，蒸餾水沖洗干凈，濾紙吸干水分，稱取1 g菌絲用濾紙包好，保存于-20℃下備用。

1.1.5 DNA提取

取1 g菌絲放入研缽，加入液氮迅速研磨成粉末，轉(zhuǎn)入7 mL的離心管，采用CTAB法提取DNA，-20℃保存?zhèn)溆茫唧w操作參考文獻(xiàn)[3]、[4]。

1.1.6 ISSR擴(kuò)增

ISSR 反應(yīng)體系 25 μL：模板 DNA 1.2 ng·μL-1，引物0.4 μmol·L-1，dNTPs 0.2 mmol·L-1，MgCl22 mmol·L-1，Taq DNA聚合酶2 U，PCR緩沖液1×，具體操作參考文獻(xiàn)[3]、 [4]，將重復(fù)性好、強(qiáng)度較高、清晰可辨無爭議、能體現(xiàn)菌株間差異的條帶確認(rèn)為標(biāo)記條帶，進(jìn)行相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)和分析。

1.1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

ISSR擴(kuò)增產(chǎn)物以0、1統(tǒng)計(jì)建立ISSR數(shù)據(jù)庫。將相同引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中電泳遷移率一致的標(biāo)記條帶確認(rèn)為同一條帶，擴(kuò)增陽性記錄為“1”，擴(kuò)增陰性記錄為“0”，利用SPSS10.0分析軟件的Jaccard方法計(jì)算樣品間的遺傳相似性，用類平均法（UPGMA） 對ISSR統(tǒng)計(jì)形成“0/1”表型數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行聚類分析，生成遺傳距離聚類圖[5,6]。

1.1.8 出菇實(shí)驗(yàn)

栽培出菇實(shí)驗(yàn)參考劉斌等[7]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR結(jié)果與分析

從20個(gè)引物篩選出4個(gè)多態(tài)性好的引物（表2），擴(kuò)增的結(jié)果見圖1。

表2 ISSR引物序列

圖1-1 引物ISSR5和ISSR12對巨大革耳菌株ISSR-PCR擴(kuò)增圖譜

圖1-2引物ISSR13和ISSR15的擴(kuò)增電泳圖

從圖1中可知，4個(gè)引物對9個(gè)菌株擴(kuò)增的片段大小在1.0 kb～3.0 kb之間，各個(gè)引物擴(kuò)增的位點(diǎn)數(shù)分別為7、8、5、7，平均位點(diǎn)數(shù)為6.25；平均每個(gè)引物產(chǎn)生個(gè)5.75個(gè)多態(tài)性條帶。ISSR共擴(kuò)增出27個(gè)位點(diǎn)，多態(tài)性條帶總共為23，多態(tài)率為85.19%。經(jīng)過軟件處理后，建立樹狀圖 （圖 2）。

圖2 9個(gè)菌株的ISSR聚類樹狀圖

從圖2可以看出，5號、6號、7號、9號菌株聚為一類，它們的相異系數(shù)為0，可能為同種異名；3號、4號菌株及1號、8號菌株各聚為一類，2號菌株單獨(dú)一類；2號菌株與其它8個(gè)菌株的遺傳距離很遠(yuǎn)，3號、4號、1號、8號菌株與5號、6號、7號、9號菌株有一定的遺傳距離。當(dāng)相異系數(shù)D為0.20水平上，9個(gè)菌株聚為2類：Ι類包括2號菌株；Π類包括1號、3號、4號、5號、6號、7號、8號、9號菌株。2號菌株與其它8個(gè)菌株的遺傳距離很遠(yuǎn)，故對9個(gè)菌株進(jìn)行了栽培出菇實(shí)驗(yàn)，以觀察子實(shí)體的形態(tài)是否有差異。

2.2 子實(shí)體形態(tài)分析

根據(jù)栽培出菇實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，C.m0002菌株的子實(shí)體（圖3）明顯不同于其它菌株，酷似多脂鱗傘（黃傘），是同名異種，單獨(dú)歸為Ι類；其它8個(gè)菌株均為巨大革耳，子實(shí)體的形態(tài)較一致，部分菌株的子實(shí)體形態(tài)見圖4、圖5和圖6，歸為第Π類。子實(shí)體特征分析的結(jié)果與ISSR分類的結(jié)果吻合。

圖3 C.m002菌株的子實(shí)體圖

圖4 C.m003菌株的子實(shí)體圖

圖5 C.m001菌株的子實(shí)體圖

圖6 C.m007菌株的子實(shí)體圖

3 討論

近年來，不斷快速發(fā)展的DNA分子標(biāo)記技術(shù)越來越多的被應(yīng)用在研究種質(zhì)資源的多樣性以及分子輔助遺傳育種上，顯示出了極大的優(yōu)越性。它不僅能快速的獲得分析結(jié)果，而且其結(jié)果不受外界環(huán)境因素和生長發(fā)育階段的影響；所以，分子標(biāo)記已經(jīng)成為分子水平的種質(zhì)資源親緣關(guān)系及檢測種質(zhì)資源多樣性和品種鑒定的有效工具[8]。

ISSR是由 Zietkiewi CZ等[9]創(chuàng)建的一種簡單重復(fù)序列間擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記。ISSR技術(shù)與常規(guī)PCR有相同的反應(yīng)條件，該技術(shù)克服了限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性RFLP標(biāo)記、SSR標(biāo)記和隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記（RAPD）的技術(shù)限制，具有操作簡單、引物擴(kuò)增的結(jié)果重現(xiàn)性較好、模板DNA用量少等優(yōu)點(diǎn)，且不需要知道基因組序列，可以檢測基因組許多位點(diǎn)的差異[6-8]，已廣泛應(yīng)用于動植物種質(zhì)鑒定、遺傳作圖和基因定位，尤其在分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)貧乏的作物研究中顯示出極大的優(yōu)勢[10,11]。但在食用菌中的應(yīng)用還不多，在香菇[8]、杏鮑菇[12]、金針菇[13]、松口蘑及花鵝膏菌[11]、天麻[14]、側(cè)耳屬[10]等品種的鑒定及親緣關(guān)系研究中的應(yīng)用已有報(bào)道，但用ISSR技術(shù)分析巨大革耳菌株間的親遠(yuǎn)關(guān)系目前沒有相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。

9個(gè)菌株的 ISSR分析中，5號（C.m0005）、6號（C.m0006）、7號 （C.m0007）、9號 （C.m0009） 的遺傳距離為零，結(jié)合子實(shí)體的形態(tài)特征可認(rèn)定它們?yōu)橥N內(nèi)的菌株。C.m0003、 C.m0004、 C.m0005、 C.m0006、 C.m0007、 C.m0008、C.m0009七個(gè)栽培菌株分別來自武漢、湖北嘉魚、福州、三明4個(gè)不同的地方，其中C.m0008與其它6個(gè)菌株有一定的遺傳距離，說明有一定的遺傳多態(tài)性，但不豐富。而C.m0001和C.m0002菌株與其它7個(gè)菌株間的遺傳距離較遠(yuǎn)。出菇實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，C.m0002菌株的子實(shí)體似多脂鱗傘（黃傘），是同名異種；其它8個(gè)菌株均為巨大革耳。本研究的結(jié)果以及ISSR標(biāo)記在香菇、杏鮑菇、金針菇、側(cè)耳屬等的應(yīng)用，說明ISSR分子標(biāo)記在食用菌的種質(zhì)資源遺傳多樣性、親緣關(guān)系分析中的應(yīng)用是可信的。本研究結(jié)果也將為巨大革耳的生產(chǎn)和育種以及種菌管理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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