劉振東，趙丹丹，孫 越，王 靜，雷 虹，董澤軍，張彥龍**

（1.黑龍江大學生命科學學院，微生物黑龍江省高校重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150080；2.中科院昆明植物研究所，植物化學與西部植物資源持續(xù)利用國家重點實驗室，云南 昆明 650204）

黑木耳也稱木耳、云耳、光木耳，是木耳屬中分布最廣泛的種之一[1]，它隸屬于擔子菌門、層菌綱、木耳科、木耳屬，學名為Auricularia auricula（L.ex Hook） underw[2]。

西藏林芝地區(qū)位于青藏高原東南部，雅魯藏布江下游，被喜馬拉雅山脈、念青唐古拉山脈和橫斷山脈形成的群山環(huán)繞[3]，自然條件復雜而獨特，由于受印度洋季風影響，這里夏季雨量充沛，形成了豐富多樣的植物及森林植被，同時林下也孕育著大量的食用菌資源，由于西藏獨特的地理條件，使該地區(qū)的野生食用菌的種質資源相對獨立。當地產的野生黑木耳，耳形好，口感佳，深受廣大消費者的青睞。我國目前用于生產的黑木耳菌種老化、產量下降，同種異名的現象十分嚴重，因而遠源新品種的開發(fā)對黑木耳產業(yè)的發(fā)展至關重要。本研究通過對在林芝地區(qū)不同地點采集到的20株優(yōu)良菌株，進行篩選與鑒定，最后得到1株優(yōu)良菌株。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 培養(yǎng)基

母種培養(yǎng)基配方（cPDA培養(yǎng)基）：去皮馬鈴薯200 g（煮汁100 mL）、葡萄糖20.0 g、KH2PO43.0 g、MgSO41.5 g、瓊脂14.0 g，補水至1 000 mL。

原種培養(yǎng)基配方：木屑（闊葉硬雜木）78%、麥麩（或米糠）20%、石膏1%、白砂糖1%，含水量60%。

栽培種培養(yǎng)基配方：木屑（闊葉硬雜木）84%、麥麩10%、黃豆粉2%、玉米粉2%、石灰1%、石膏1%，含水量65%。

cPDA液體培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g（煮汁1 000 mL）、葡萄糖20.0 g、硫酸鎂1.5 g、磷酸二氫鉀3.0 g、蛋白胨0.5 g、維生素B110.0 mg，加蒸餾水定容至1 000 mL。

1.1.2 菌株

篩選菌株：從西藏林芝地區(qū)米林、郎縣、工布江達、波密、察隅、墨脫等地的20個不同地點采集得到，編號為X1~X20。

對照菌株黑29（黑龍江省應用微生物研究所）、9809（東寧縣食用菌研究所）。

1.2 試驗方法

1.2.1 純種分離

首先將野外采集的野生菌株標本核對原始序號，后用高錳酸鉀-甲醛溶液進行熏蒸處理30 min，最后將處理過的子實體置于超凈工作臺上進行無菌分離[4]，將分離出來的黃豆粒大小的子實體接種到PDA培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)15 d后，對菌絲進行純化，方法是在菌落邊緣挑取尖端菌絲體，移殖到試管培養(yǎng)基斜面上，在25℃下培養(yǎng)，如此重復3次。純化后的菌種接入裝有木屑培養(yǎng)基的試管中，作為備份。

1.2.2 初篩（生理性能測定）

將分離得到的20株菌株與對照菌株，分別接種到PDA綜合培養(yǎng)基，置于24℃~25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24 h觀察1次，并記錄各菌絲的生長速度及菌落形態(tài)，并用瓊脂糖擴散法[5]進行拮抗分析。拮抗反應的形態(tài)特征按照《綠色食品食用菌NY/T749-2003》規(guī)定的定義判[6]。

1.2.3 復篩（菌株比較試驗）

將初篩入選的8株菌株進行復篩，每個菌株分別培養(yǎng)1 000袋栽培種，從中隨機抽取400袋進行栽培試驗。具體擴培比例是1支試管一級菌種→5袋二級菌種→400袋三級菌（栽培種），在菌種逐級擴培過程中定時觀察，記錄各菌株在各級培養(yǎng)基上的萌發(fā)時間、菌絲生長情況、抗污染能力。在田間管理階段觀察記錄個菌種子實體的產量及商品性能。

纖維素酶活力測定，用3,5-二硝基水楊酸法[7]測定菌絲生長階段和出耳階段的纖維素酶活力，接種20 d后，定期對菌袋取樣，每次取培養(yǎng)料20.0 g放于燒杯中，加入40 mL生理鹽水后立即封口，在40℃水浴條件下提取酶液后過濾，并吸取3 mL酶液利用比色法進行測定。

1.2.4 優(yōu)良菌種鑒定

（1）液體菌種的制備

將80 mL cPDA液體培養(yǎng)基裝入250 mL三角瓶中，121℃滅菌 30 min。

冷卻后接入適齡的斜面菌絲片段，25℃靜止培養(yǎng)2 d~3 d，然后在130 r·min-1搖床培養(yǎng) 3 d~5 d。

（2） DNA的提取

黑木耳液體菌種擴培后，收集0.1 g菌絲體置于液氮中研磨，之后采用CTAB法提取基因組DNA并用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，具體過程按賈定洪等的方法進行[8]。

（3） ITS序列的PCR擴增

ITS序列采用真菌通用引物[9]ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和 ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）進行PCR擴增，引物由上海Sangon公司合成，擴增在Biometra T1 Thermocycler PCR儀上進行，PCR擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，然后用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進行回收。

（4） ITS片段的克隆

將PCR純化產物與PMD-18T Vector（Takara公司）連接后，轉化至大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞中，用含XGal、IPTG、Amp LB平板篩選，挑白色菌落培養(yǎng)，提取質粒做PCR檢測。

（5） 測序

電泳檢測陽性克隆成功后，將該管菌液送往測序北京生工測序公司進行測序。

（6）系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

將測得的優(yōu)良菌株的ITS序列在GenBank上進行BLAST分析，利用軟件Clustal X進行同源性比較，利用MEGA4軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1 初篩結果

將20株菌株接種在PDA斜面試管和PDA培養(yǎng)皿上，其生長情況與對照菌株的生長情況進行比較，結果有8株因與對照菌株相比生長速度慢、長勢弱而被淘汰。

拮抗實驗是為了檢測各菌株間是否為獨立的菌株，淘汰那些編號不同但基因型相同的菌株，結果有4株菌株因無拮抗現象發(fā)生而被淘汰。

2.2 復篩結果

實驗菌株與對照菌株在各級培養(yǎng)基上的生長速度情況見表1。

表1 實驗菌株與對照菌株在各級培養(yǎng)基上的生長速度

由表1可知，菌株6號、7號生長旺盛，菌絲粗壯、潔白。纖維素酶活力比較情況見表2。

表2 纖維素酶活力比較

由表2可知，X6菌株的纖維素酶活力居參試菌株和對照菌株之首。自然條件下三級菌抗污染能力及產量情況見表3。

由表3可知，6號菌株產量達到48 g·袋-1，高于其他試驗菌株與對照菌株。雜菌率方面除2號和7號菌株與對照菌株中黑29持平外，其他試驗菌株的雜菌率都低于對照菌株。商品性能分析見表4。

通過對各菌株商品性能的比較分析可知，4號、6號、7號、14號和17號菌株大多呈片狀或者碗狀，表現為小根且易開片。

綜合以上各指標可確定西藏6號，為優(yōu)良菌株，結果見圖1。

2.3 鑒定結果

表3 自然條件下三級菌抗污染能力及產量

表4 商品性能分析

圖1 X6菌株子實體與三級菌菌袋

用CTAB法提取黑木耳液體菌種基因組DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果見圖2。

圖2 電泳檢測結果

由圖2可知，提取的DNA條帶清晰，b、c沒有明顯的拖尾現象，說明DNA無蛋白質及RNA污染，完整性較好，可用于后續(xù)實驗。18Sr DNA PCR擴增的瓊脂糖凝膠電泳結果見圖3。

圖3 18Sr DNA的PCR擴增的瓊脂糖凝膠電泳（1%）

由圖3可知，所獲得的電泳條帶600 bp左右，與預期結果一致。轉化子通用引物PCR鑒定結果見圖4。

圖4 轉化子通用引物PCR鑒定

由圖4可知，菌液均出現特異性條帶，可初步取定轉化子為陽性?；贗TS序列構建的黑木耳屬系統(tǒng)發(fā)育樹見圖5。

圖5 基于ITS序列構建的黑木耳屬系統(tǒng)發(fā)育樹

通過系統(tǒng)進化樹可知，X6菌株與數據庫中的黑木耳菌株916為主的亞群處在同一分支上，因此可以確定被鑒定的優(yōu)良菌株X6與黑木耳菌株916同源性最大，同為木耳屬黑木耳種。

3 結論

本研究中供試材料均采自林芝地區(qū)境內有野生黑木耳分布，且周邊無人工栽培黑木耳的深山，從而最大程度排除材料受人工栽培種質漂移的可能性。通過對采集并且分離得到的20株優(yōu)良野生黑木耳菌株，進行常規(guī)的菌種篩選研究，最終篩選出了優(yōu)良菌株X6，其在菌絲生長速度、長勢、抗雜能力等方面均優(yōu)于其他菌株與對照菌株。

本研究采用rDNA-ITS序列對所得優(yōu)良菌株進行分子鑒定，因為該序列變異較快，可提供比較豐富的變異位點和信息位點，因此可作為一種分子標記用于探討真菌種內變異和屬內種間分子系統(tǒng)關系[10，11]。近年來鑒于ITS序列方便、快速的特點，因此經常用于鑒定一些未知植株，如侯軍利用ITS序列對疑似菌株白羊肚菌進行了初步分子鑒定[12]。本試驗對所篩選得到的X6菌株，進行鑒定的結果顯示，X6菌株與數據庫中的黑木耳916菌株處于同一分支，由此可斷定X6菌株為木耳屬黑木耳種。

明確了X6菌株的優(yōu)良性能及其種屬關系后，建議該菌種可作為林芝地區(qū)人工袋料栽培黑木耳的母種進行推廣使用。

[l]張金霞，謝寶貴.食用菌菌種生產與管理手冊[M].北京：中國農業(yè)出版社，2006.

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