章偉韜，曹 宇，梅 翔，陳海容，范 開，

(1.重慶理工大學 藥學與生物工程學院 ，重慶 400054;2.重慶富進生物醫(yī)藥有限公司，重慶 400041)

T4核酸內切酶 V(T4 endonuclease V，簡稱T4N5)是 T4噬菌體感染宿主 E.coli后由基因DenV表達的一種DNA修復酶。該分子含有138個氨基酸殘基，理論分子質量為16.0785 kDa。它能特異性地識別DNA胸腺嘧啶二聚體，并在該損失部位切斷磷酸二酯鍵，從而啟動體內的DNA切除修復途徑，從而有效防止紫外線輻射引起皮膚病變［1］。

脂質體是一種藥物載體新劑型，由磷脂、膽固醇等為膜材包合而成。脂質體可以將藥物粉末或溶液包埋在直徑為納米級的微粒中，這種微粒具有類細胞結構，在人體體表可以直接與細胞膜結合，從而提高上皮細胞對藥物的吸收度［2］。運用脂質體包埋的T4N5能夠有效穿透皮膚角質層，直達皮膚患處。

本實驗對T4N5抗紫外線損傷作用進行了動物學實驗研究。實驗使用的T4N5采用融合表達制備［1］，為脂質體凝膠。實驗動物為昆明小鼠，褪毛后皮膚暴露于固定強度的紫外線下照射，觀察對照組、模型組、給藥組和安慰劑組皮膚組織變化情況，并予以分析討論。

1 實驗材料與方法

1.1 材料

動物:昆明小鼠32只，購于重慶醫(yī)科大學實驗動物中心，7周齡，體質量40 g左右，雌性，按清潔動物標準條件分籠飼養(yǎng)。

主要儀器:UVB紫外線燈管，型號為TL20W/12RS，荷蘭PHILIPS公司生產;紫外線照度計，型號為UV2000，杭州遠方光電信息有限公司生產。

實驗藥物:T4N5脂質體凝膠，委托重慶富進生物醫(yī)藥有限公司生產，批號20101104，蛋白濃度0.2 mg/mL，4℃保存;安慰劑脂質體凝膠，委托重慶富進生物醫(yī)藥有限公司生產，批號20101001，4℃保存。

1.2 實驗動物的造模

1.2.1 動物分組及前處理。昆明小鼠隨機分籠，分為4組:① 對照組;② 照射組;③ 安慰劑組;④照射給藥組。用苦味酸進行標記。在小鼠背部剪去體表長毛，用0.2 g/mL硫化鈉處理［3］，進行脫毛，脫毛區(qū)約為3.0 cm ×5.0 cm。

1.2.2 紫外線損傷模型的建立。除第①組外，對其余各組小鼠進行以下實驗:開啟UVB紫外線燈，預熱15 min，使光源發(fā)出的紫外線強度穩(wěn)定［4］;固定光源距小鼠背部距離約為25 cm，紫外線輻照度計測定輻照強度為0.35 mW/cm2;每天照射2次，每次照射30 min，間隔時間為12 h;實驗周期為10 d，總輻照量為12.6 J/cm2;照射期間停止給水給食，照射后0.5 h恢復。

1.2.3 實驗動物的飼養(yǎng)管理。所有小鼠按清潔動物標準條件分籠喂養(yǎng)，飼喂鼠顆粒飼料，飲水為滅菌生活飲用水。飼養(yǎng)溫度20～22℃，濕度50% ～60%，保持換氣通風［5－6］。實驗期間不進行自然采光，采用紅光照明，防止細胞 DNA光修復的發(fā)生［7］。

1.3 實驗動物的給藥

從第4 d照射起，第③組和第④組開始給藥，給藥時間為照射后15 min，給藥量為0.25 mL/次，給藥方式為外用，方法為用滅菌棉簽均勻涂抹于照射部位。

1.4 圖像采集

在第10 d最后一次實驗后，對所有小鼠脫毛區(qū)照射部位進行圖像采集。

1.5 組織學標本采集

圖片采集后，用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射，麻醉小鼠，手術取下實驗照射部位皮膚，立即浸入10%福爾馬林中，固定24 h后取出，HE染色后浸蠟、包埋，然后切片［8］。

2 實驗結果

2.1 皮膚表面圖像分析

4組小鼠的皮膚情況(圖1):對照組小鼠皮膚光滑細膩，未見明顯病理性變化;照射組和安慰劑組小鼠表皮出現大面積紅斑，并且結痂皴裂、起皺;UVB照射給藥組小鼠皮膚光滑細膩，肉眼可見少量紅斑。

圖1 小鼠脫毛區(qū)照射部位圖像

2.2 組織學標本

HE染色切片(圖2)顯示:對照組、UVB照射給藥組小鼠皮膚較薄，真皮內主要細胞有成纖維細胞和巨噬細胞;UVB照射表皮及真皮層壞死，表皮層增厚，組織結構紊亂，皮脂腺及毛囊明顯減少，有局部增生，皮下組織水腫，伴有中性粒細胞浸潤。

圖2 小鼠脫毛區(qū)照射部位HE染色(10×40)

3 結束語

本研究表明，T4N5修復酶具有良好的修復皮膚紫外線損傷的能力，可有效減少了紫外線UVB造成的皮膚損傷。目前國內尚未有將T4N5修復酶應用于藥學和生物醫(yī)學方面的文獻報道。在國外，美國TPSG公司將T4N5包埋于脂質體中，作為護膚產品的主要成分;美國AGI公司開發(fā)的T4N5脂質體已在皮膚癌的預防和治療中進入III期臨床試驗［9］。隨著T4N5脂質體重組制備工藝的完善和成熟［1］，將其開發(fā)成修復紫外線所致的皮膚損傷的藥物或者化妝品將具有可觀的經濟價值和臨床應用前景。

［1］范開，陳海容.融合表達重組制備T4核酸內切酶V［P］.中國專利，申請?zhí)?01010552859.5.

［2］楊彤.新型脂質體的研究進展［J］.醫(yī)藥導報，2009(3):336-338.

［3］朱彥君，馮光珍.皮膚光老化動物模型的建立［J］.中國體視學與圖像分析，2004，9(1):51-54.

［4］朱愉，多秀瀛.實驗動物的疾病模型［M］.天津:天津科技翻譯公司出版，1991:557-559.

［5］郭魯義，李春雨.實用光老化動物模型建立方法的探討［J］.中國美容醫(yī)學，2008，17(2):235-237.

［6］張璃，梁虹.小白鼠皮膚光老化模型的建立［J］.廣東醫(yī)學，2005，26(12):1642-1643.

［7］王鏡巖，朱圣庚.生物化學:下冊［M］.3版.北京:高等教育出版社，2002:406-437.

［8］杜卓民.實用組織學技術［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2001:8-294.

［9］Cafardi J A，Elmets C A.T4 endonuclease V:review and application to dermatology［J］.Expert Opinion on Biological Therapy，2008(6):829-838.