謝 敏，萬(wàn) 穎，張?jiān)鰸?，何建軍，?黎，范 開(kāi)

(1.重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶 400054;2.重慶富進(jìn)生物醫(yī)藥有限公司，重慶 400041)

天然野生型 hKGF－1(keratinocyte growth factor－1，KGF－1)［1］由163 個(gè)氨基酸組成，含5 個(gè) Cys，形成 Cys1－Cys15、Cys102－Cys106兩對(duì)二硫鍵，Cys40以游離形式存在于分子內(nèi)部。全長(zhǎng)hKGF－1蛋白質(zhì)不穩(wěn)定，容易發(fā)生聚集［2－4］。已有文獻(xiàn)報(bào)道［5］:將全長(zhǎng)hKGF－1的N 端缺失23個(gè)氨基酸，只形成 Cys102－Cys106一對(duì)二硫鍵時(shí)(以下簡(jiǎn)稱(chēng)△23KGF－1)，不僅沒(méi)有影響其生物活性，還提高了穩(wěn)定性;另外，在△23KGF－1的基礎(chǔ)上針對(duì)其剩余的3個(gè)半胱氨酸依次進(jìn)行定點(diǎn)突變發(fā)現(xiàn)，只有突變102位半胱氨酸對(duì)于其穩(wěn)定性沒(méi)有影響［6］。本研究在此基礎(chǔ)上將△23KGF－1第102位的Cys突變?yōu)?Ser［7］，這種新型的 hKGF－1 突變體(以下簡(jiǎn)稱(chēng)為△23Ser102KGF－1)［8］具有抗組織纖維化的功能，但是該研究并未證明其抗纖維化的功能與樣品是否與40位和106位的二硫鍵具有相關(guān)性。本研究以大鼠試驗(yàn)性肝纖維化和肝星狀細(xì)胞為模型，進(jìn)一步明確△23Ser102KGF－1突變體中的抗肝纖維化的功能與樣品中Cys102－Cys106這對(duì)二硫鍵的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與藥品

△23KGF－1、△23Ser102KGF－1 和△23Ser102C40－C106KGF－1凍干粉，重慶富進(jìn)生物醫(yī)藥有限公司提供，純度99.0%，批號(hào) 20100603;羥脯氨酸試劑盒(堿)，南京建成生物工程研究所制造，批號(hào)110213;CCl4，重慶化學(xué)試劑廠生產(chǎn)，批號(hào)100405;人肝星狀細(xì)胞系，武漢細(xì)胞所提供;DMEM高糖培養(yǎng)基(1×)，賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司生產(chǎn)，批號(hào) NWF6420;胎牛血清，Invitrogen公司生產(chǎn)，批號(hào)619559;乙腈，默克公司生產(chǎn)，色譜純;三氟乙酸，美國(guó)TEDIA生產(chǎn)。

1.2 主要儀器與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量220～250 g，由解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供;7600全自動(dòng)生化分析系統(tǒng)，日本日立公司制造;SpectraMax190型酶標(biāo)儀，美國(guó) Molecular Devices公司制造;CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(型號(hào)HF151UV)，日本三洋公司制造;安捷倫1100高效液相色譜系統(tǒng);DAD檢測(cè)器;二元輸液泵;ultimate XB－C18色譜柱，規(guī)格:4.6 ×250 mm，5 μm，300?。

1.3 方法

1.3.1 結(jié)構(gòu)確認(rèn)

將△23Ser102KGF－1 和△23Ser102C40－C106KGF－1凍干粉通過(guò)還原和非還原肽圖分析其二硫鍵的形成情況。樣品處理及色譜條件參照《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版第3部附錄ⅧE“肽圖檢查法”。

1.3.2 人肝星狀細(xì)胞系體外活性測(cè)定

將人肝星狀細(xì)胞系(hepatic stellate cell，HSC)快速解凍并培養(yǎng)于含有10%FBS和0.5%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基，37℃，5%CO2培養(yǎng)6 h，待細(xì)胞貼壁后更換新的含有10%FBS和0.5%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜。用0.5%胰蛋白酶消化細(xì)胞傳代2次后用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，并轉(zhuǎn)移至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔約5000個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)8 h。待細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基換成含有1.0%FBS和0.5%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基進(jìn)行饑餓過(guò)夜培養(yǎng)。樣品的稀釋:① TGF－1陽(yáng)性對(duì)照藥用含有1.0%FBS和0.5%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋成 200、40、8、1.6、0.32IU 五個(gè)梯度，并設(shè)2個(gè)復(fù)孔。② △23KGF－1、△23Ser102KGF－1 和△23Ser102KGF－1 C40－C106三種樣品均稀釋成0.32 ng、1.6 ng、8 ng、40 ng、200 ng、1 μg 六個(gè)梯度，并設(shè)2個(gè)復(fù)孔。饑餓培養(yǎng)結(jié)束后將上層培養(yǎng)基移除，并將上述稀釋好的陽(yáng)性對(duì)照藥、3種樣品以及陰性對(duì)照組加入細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔200 μL，于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后用MTS于37℃染色1 h，490 nm處測(cè)定OD值。

1.3.3 肝纖維化模型的建立和治療

SD大鼠于清潔條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分成5組:空白對(duì)照組、模型組、△23KGF－1組、△23Ser102KGF－1 組 和 △23Ser102C40－C106KGF－1組，每組6只。

模型的建立:模型組和給藥組用20%CCl4灌胃(CCl4與玉米油1∶4混合)，劑量2 mL/kg，每周2次，連續(xù)8周。

給藥:造模的同時(shí)，正常對(duì)照組和模型組腹部皮下注射適量生理鹽水，每天1次，連續(xù)8周?！?3KGF－1、△23Ser102C40－C106KGF－1 和△23Ser102KGF－1造模同時(shí)腹部皮下注射藥物，劑量為3 mg/kg，每天1次，連續(xù)8周。所有大鼠在第56 d處死，股動(dòng)脈收集血液進(jìn)行血液生化指標(biāo)的測(cè)定，并取新鮮的肝組織相對(duì)固定的位置進(jìn)行甲醛固定、制片和羥脯氨酸的測(cè)定。

1.3.4 檢測(cè)指標(biāo)

取大鼠的血清進(jìn)行谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶的測(cè)定。取新鮮的肝組織進(jìn)行羥脯氨酸的測(cè)定。取大鼠肝臟用福爾馬林進(jìn)行固定，Masson染色，制備成病理切片。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

將大鼠的谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和羥脯氨酸含量用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行t分布計(jì)算和標(biāo)準(zhǔn)差分析，結(jié)果用ˉx±s表示，P＜0.05表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)分析

由圖1可見(jiàn)在非還原肽圖中保留時(shí)間為21 min的峰經(jīng)還原肽圖處理后變成19 min和24 min的2 個(gè)峰，證明△23Ser102C40－C106KGF－1 組的樣品含有1對(duì)二硫鍵，且形成完全，因?yàn)闃悠分缓?0位和106位2個(gè)半胱氨酸，因此可以確定△23Ser102C40－C106KGF－1 組含有 C40－C106這一對(duì)二硫鍵。由圖2可見(jiàn)△23Ser102KGF－1組的還原肽圖和非還原肽圖可以完全重合，因此可以說(shuō)明△23Ser102KGF－1組不含二硫鍵。

2.2 3種KGF－1突變體對(duì)hHSC體外測(cè)活結(jié)果

由圖3結(jié)果可見(jiàn):與△23KGF－1和△23Ser102C40－C106KGF－1 兩組相比，△23Ser102KGF－1 組對(duì)人HSC細(xì)胞系有明顯的抑制作用，并且與劑量呈正相關(guān)性;△23KGF－1 和 △23Ser102C40－C106KGF－1 兩組抑制作用不明顯。由圖4可見(jiàn)，與空白組相比，TGF－1有明顯的刺激作用，這與文獻(xiàn)報(bào)道的一致［9］。

圖4 TGF和空白2個(gè)樣品對(duì)人肝星狀細(xì)胞系的作用

2.3 血液生化指標(biāo)和羥脯氨酸檢測(cè)結(jié)果

由表1結(jié)果可見(jiàn):與模型組比較，△23Ser102KGF－1組大鼠血清 AL T、AS T水平均明顯降低(P＜0.05)，同時(shí)對(duì)肝組織中Hyp量的升高也有一定抑制作用(P＜0.05);但未見(jiàn)△23KGF－1組和△23Ser102C40－C106KGF－1 組對(duì) AL T、AS T 和 Hyp有明顯影響。

表 1 △23KGF－1、△23Ser102KGF－1 和△23Ser102C40－C106KGF－1 三個(gè)樣品的谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和羥脯氨酸結(jié)果

2.4 大鼠肝臟病理組織學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果

由病理切片(圖5)可見(jiàn):連續(xù)造模4周后，模型組肝組織正常結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，肝細(xì)胞索排列紊亂并且水腫，匯管區(qū)和中央靜脈區(qū)可見(jiàn)肝細(xì)胞大面積死亡，炎細(xì)胞浸潤(rùn)嚴(yán)重，大量脂肪細(xì)胞變性，膠原纖維明顯并形成了假小葉，大部分動(dòng)物肝纖維化程度達(dá)到5級(jí);△23Ser102KGF－1組與正常組相比可見(jiàn)部分肝脂肪細(xì)胞變性，以水樣變形為主，少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)局部細(xì)小纖維增生但未形成間隔，細(xì)胞索排列較整齊，肝纖維化程度多為1～2級(jí);△23Ser102C40－C106KGF－1 組大量脂肪細(xì)胞變性，肝細(xì)胞索排列紊亂并且呈水樣變性，少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)局部細(xì)小纖維增生但未形成間隔，大部分動(dòng)物肝纖維化程度達(dá)到2～3級(jí);△23KGF－1組肝組織正常結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，肝細(xì)胞索排列紊亂并且水腫，氣球樣變，匯管區(qū)和中央靜脈區(qū)可見(jiàn)肝細(xì)胞大面積死亡，炎細(xì)胞浸潤(rùn)嚴(yán)重，大量脂肪細(xì)胞變性，膠原纖維明顯并形成了假小葉，大部分動(dòng)物肝纖維化程度達(dá)到5級(jí)或以上。

圖 5 △23KGF－1、△23Ser102KGF－1 和△23Ser102C40－C106KGF－1組的大鼠肝臟病例切片(Masson染色40倍)

3 討論

肝纖維化的過(guò)程實(shí)際上是一個(gè)肝臟細(xì)胞受損的應(yīng)激過(guò)程。當(dāng)肝細(xì)胞受到機(jī)械損傷或者病毒感染等不良刺激之后，肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)被激活，并大量合成細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)［10］，從而加速了肝纖維化的進(jìn)程。實(shí)際上，肝纖維化的過(guò)程是一系列細(xì)胞因子與其受體相互作用的結(jié)果，例如TGFβ－1及其受體TRⅠ、IL－1及其受體等，這些細(xì)胞因子與其受體結(jié)合并作用，從而刺激肝星狀細(xì)胞等的分裂，導(dǎo)致病情的加重，由此可見(jiàn)細(xì)胞因子是肝纖維化最重要的一環(huán)，因此如何抑制細(xì)胞因子的分泌和阻斷受體的結(jié)合就成為了肝纖維化治療的靶點(diǎn)。本研究組在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中將3種突變的細(xì)胞因子直接作用于人肝星狀細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn):KGF－1突變體蛋白不含Cys40－Cys102二硫鍵組，可明顯抑制人肝星狀細(xì)胞系的生長(zhǎng)，因此可以推斷KGF－1突變體的抗纖維化作用可能跟抑制肝星狀細(xì)胞的生長(zhǎng)并間接影響其生長(zhǎng)因子的分泌有關(guān)。

文獻(xiàn)［11］報(bào)道蛋白質(zhì)二硫鍵的形成與否可以改變蛋白質(zhì)的三級(jí)或者四級(jí)結(jié)構(gòu)，從而影響其空間構(gòu)象和功能。本實(shí)驗(yàn)用大鼠實(shí)驗(yàn)性肝損傷和人肝星狀細(xì)胞系進(jìn)一步證明了蛋白質(zhì)的二硫鍵會(huì)影響其生物學(xué)功能。本實(shí)驗(yàn)不僅對(duì)于抗纖維化的機(jī)理和研發(fā)新型抗纖維化藥物具有比較重大的意義，而且本實(shí)驗(yàn)探討的蛋白質(zhì)的功能與二硫鍵的關(guān)系還可以為以后深入研究蛋白質(zhì)的構(gòu)效關(guān)系提供參考。

［1］Rubin J S，Osada H，F(xiàn)inch P W，et al.Purification and characterization of a newly indentified growth factor specific for epithelial cells［J］.ProcNatlAcadSciUSA，1989(86):802－806.

［2］Yueh－Rong Hsu，Eric W J.Human Keratinocyte Growth Factor Recombinantly Expressed in Chinese Hamster O－vary Cells:Isolation of Isoforms and Characterizationof Post－Translational Modifications［J］.Protein expression and purification，1998(12):189－200.

［3］Alarid E T，Rubin J S，Young P，et al.Keratinocyte growth factor functionsin epithelial induction during seminal vesicle development［J］.ProcNatlAcadSciUSA，1994，91(3):1074－1078.

［4］Staiano－Coico L，Krueger J G，Rubin J S，et al.Human keratinocyte growth factor effects in a porcine model of epidermal wound healing［J］.J Wed，1993(178):865－878.

［5］Lance A B，Marlene B，Shefali G.Denise Idler，and Per－Erik Mansson Ohmeda，PPD，100 Mountain Acenue，Murray Hill，NJ 07974 Effect of cysteine substitutions on the mitogenic activity and stability of recombinant human ketatinocyte growth factor［Z］.1999:872－879.

［6］Eric H，Timothy O.Enhanced Stability of recombinant keratinocyte growth factor by mutagenesis Protein Engineering［J］.Design ＆Selection，2006，19(4):147－153.

［7］張?jiān)鰸惽?重組人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子Ⅰ型缺失突變體二硫鍵配對(duì)與生物活性［J］.重慶理工大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2010(4):23－26.

［8］霍黌琦，李新平，范開(kāi).重組人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子的體內(nèi)外作用研究［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，2005，40(22):1749－1752.

［9］姜虹，李定國(guó).TGF－β1與肝纖維化［J］.世界華人消化雜志，2003，3(11):326－329.

［10］唐東，吳建新.肝組織特異性基因啟動(dòng)子靶向干預(yù)肝纖維化的研究現(xiàn)狀［J］.國(guó)際消化病雜志，2011，31:97－100，111.

［11］楊錫昌.蛋白質(zhì)四級(jí)結(jié)構(gòu)中的二硫鍵［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1986(4):108－201.