謝寅峰 張志敏 張穎穎 孫 朦 尚旭嵐 方升佐

(南京林業(yè)大學(xué)，南京，210037)

青錢柳(Cyclocarya paliurus(Batal.)Iljinskaja)又名搖錢樹、麻柳、青錢李等，系胡桃科(Juglandaceae)青錢柳屬植物，是我國特有的珍稀單種屬植物，國家重點保護瀕危植物之一，青錢柳為多用途樹種，具藥用、材用和觀賞價值［1－2］。目前，現(xiàn)有的青錢柳資源主要是天然林，不僅數(shù)量少，而且多零星散布于深山老林和一些自然保護區(qū)中。青錢柳由于種子敗育并具有深休眠等諸多因素造成其繁殖較困難［3］，國內(nèi)外尚無大量人工繁殖和栽培青錢柳的成功經(jīng)驗，相關(guān)方面的研究報道也較少。愈傷組織可以作為研究植物脫分化和再分化、生長和發(fā)育、遺傳和變異、育種及次生代謝物生產(chǎn)的理想材料［4］，因此獲得大量愈傷組織也成為目前開發(fā)利用青錢柳資源的一個重要研究方向。

為了獲得大量狀態(tài)較好的青錢柳愈傷組織，本文在前期愈傷組織誘導(dǎo)研究的基礎(chǔ)上［5］，進一步從基本培養(yǎng)基、蔗糖濃度、植物生長調(diào)節(jié)劑、稀土應(yīng)用等方面對愈傷組織增殖條件進行探討，研究結(jié)果為后續(xù)次生代謝調(diào)控、高效組培快繁體系建立等方面的研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

采自江蘇鎮(zhèn)江南京林業(yè)大學(xué)教育基地。取3年生青錢柳幼樹當年生的嫩枝作為外植體，以嫩葉作為誘導(dǎo)愈傷組織的材料。愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件見文獻［5］。

1.2 增殖基本培養(yǎng)基的篩選

采用單因素設(shè)計，采用WPM、改良DKW(硼酸減為1/3，VB1和甘氨酸增加1倍)、MS、改良 MS(3/4MS)、DY、B5等6種培養(yǎng)基進行增殖試驗。添加2 mg/L 6－BA+0.5 mg/L NAA+30 g/L 蔗糖+6.5 g/L瓊脂(國藥集團化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品)，pH調(diào)至5.8。每個處理接種6瓶，重復(fù)3次。接種后定期觀察，記錄愈傷的顏色狀態(tài)，20 d后收獲測鮮重增量和增長率。

1.3 蔗糖質(zhì)量濃度對愈傷組織增殖的影響

以改良MS 為基本培養(yǎng)基，添加20、30、40、60 g/L 蔗糖，附加2 mg/L 6－BA+0.5 mg/L NAA+6.5 g/L瓊脂，pH調(diào)到5.8。每個處理接種6瓶，重復(fù)3次。接種后定期觀察，記錄愈傷的顏色狀態(tài)，20 d后收獲測鮮質(zhì)量增量和增長率。

1.4 植物生長調(diào)節(jié)劑及其濃度對愈傷組織增殖的影響

增殖培養(yǎng)的植物生長調(diào)節(jié)劑的種類及其濃度，采用 KT、2，4－D、NAA 三因素［6］，三水平 L9(33)正交試驗設(shè)計，KT 分別為 0.2、0.5、1.0 mg/L，2，4－D分別為0.2、1.0、2.0mg/L，NAA分別為0.0、0.1、1.0 mg/L。以改良MS為基本培養(yǎng)基，添加30 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂，pH調(diào)至5.8。每處理接種5瓶，重復(fù)3次。接種后定期觀察，20 d后收獲測鮮重增量和增長率。

1.5 稀土對愈傷組織增殖的動態(tài)影響

以改良MS為基本培養(yǎng)基，添加不同質(zhì)量濃度的稀土(硝酸鑭，La(NO3)3)。質(zhì)量濃度梯度分別設(shè)為0、0.1、0.5、1、2、5、10、20、40、50 mg/L。附加 2 mg/L 6－BA+0.5 mg/L NAA+6.5 g/L 瓊脂，pH 調(diào)到5.8。每個處理接種6瓶，重復(fù)3次。接種后在20 d后測愈傷組織生長量，統(tǒng)計增長率，記錄愈傷的顏色狀態(tài)。

1.6 觀察、統(tǒng)計與數(shù)據(jù)分析

愈傷組織增長量和增長率用鮮質(zhì)量增加計算法(g/瓶):

以上數(shù)據(jù)為6瓶的平均值，重復(fù)3次。

試驗數(shù)據(jù)利用Excel，STST統(tǒng)計分析軟件進行處理，并用Duncan氏法進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 基本培養(yǎng)基對愈傷組織增殖的影響

表1結(jié)果顯示，不同基本培養(yǎng)基對青錢柳愈傷組織的增值和生長有不同程度的影響。生長量增量最大的是MS培養(yǎng)基，其次為WPM和改良DKW，差異不顯著(p＞0.05);從增長率來看，WPM培養(yǎng)基最佳，其次是改良DKW和MS，差異不顯著(p＞0.05);但從愈傷組織的顏色和狀態(tài)看，MS和改良MS效果最好，大多為淡綠色，質(zhì)地較松散，WPM培養(yǎng)基的愈傷組織部分出現(xiàn)褐色，質(zhì)地較硬。綜合以上3個因素，MS培養(yǎng)基為最佳選擇。

2.2 蔗糖質(zhì)量濃度對愈傷組織增殖的影響

表2結(jié)果表明，培養(yǎng)基中添加20～60 g/L的蔗糖，隨著蔗糖質(zhì)量濃度的增加，愈傷組織生長量的增量和增長率均呈下降的趨勢，20 g/L時增長率最高，60 g/L時增長率最低，20 g/L處理與其它質(zhì)量濃度處理間差異顯著。但從愈傷組織的顏色和狀態(tài)看，蔗糖質(zhì)量濃度為30 g/L時效果最佳，淡綠色，質(zhì)地較松散，有利于繼代培養(yǎng)。

表1 基本培養(yǎng)基對青錢柳愈傷組織增殖的影響

表2 不同質(zhì)量濃度的蔗糖對青錢柳愈傷組織增殖的影響

2.3 植物生長調(diào)節(jié)劑及其質(zhì)量濃度對愈傷組織增殖的影響

三因素三水平正交試驗結(jié)果表明，不同激素及濃度配比對青錢柳葉片愈傷組織的增殖有不同程度的影響作用。其中，KT0.2 mg/L+2，4－D0.2 mg/L組合效果最佳，平均增量和增長率都達到最高，分別為3.48 g和1024.51%，和其他處理相比均達極顯著差異(p＜0.01)。極差分析結(jié)果表明，三因素(KT、2，4－D、NAA)的 R 值分別為 267.74、346.08、103.34，說明三種激素對愈傷組織增殖的影響效果為2，4－D＞KT＞NAA，2，4－D 為影響增殖效果的主導(dǎo)因素。從愈傷組織的顏色和狀態(tài)看，隨著2，4－D質(zhì)量濃度的增大，愈傷組織分裂快、質(zhì)地疏松，但平均增量和增長率明顯下降，愈傷組織顏色由淡黃、白等淺色逐漸加深成褐、黑色。KT質(zhì)量濃度高時愈傷組織較致密，顏色鮮嫩。綜合各組合測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，愈傷組織的增殖不僅與植物生長激素的絕對量有關(guān)，還與生長激素與細胞分裂素的比例有關(guān)。當生長素/細胞分裂素為1∶1左右時(如組合KT0.2 mg/L+2，4－D0.2 mg/L 和 KT1.0 mg/L+2，4－D1.0 mg/L)，愈傷組織的增長量較大;當生長素/細胞分裂素為2 ∶1 左右時(如組合 KT1.0 mg/L+2，4－D2.0 mg/L+NAA0.1 mg/L)，愈傷組織的增長量(0.45 g)及增長率(108.80%)最低，和其它處理相比達極顯著差異(p＜0.01)。

2.4 稀土對愈傷組織增殖的影響

表3結(jié)果表明，隨著培養(yǎng)基中添加鑭稀土質(zhì)量濃度的增加，對愈傷組織增殖的影響總體上呈現(xiàn)先促進后抑制的效應(yīng)。當鑭稀土質(zhì)量濃度為0.5 mg/L時，愈傷組織的增殖效果最佳，和其他處理相比均達顯著差異(p＜0.05)。隨著鑭稀土質(zhì)量濃度的增加，愈傷組織增長率呈下降趨勢，從愈傷組織的顏色和狀態(tài)看，鑭稀土質(zhì)量濃度為0.5 mg/L時效果最佳，淡綠色，質(zhì)地較松散，有利于繼代培養(yǎng)。結(jié)果表明培養(yǎng)基中添加適宜質(zhì)量濃度的稀土能有效促進愈傷組織的生長，而濃度過高則對愈傷組織的增殖起抑制作用。

表3 鑭稀土對青錢柳愈傷組織增殖的影響

3 結(jié)論與討論

培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，基本培養(yǎng)基的種類對愈傷組織的增殖產(chǎn)生一定的影響［7］。本試驗結(jié)果表明，雖然從愈傷組織增長率來看，WPM培養(yǎng)基最佳。但從愈傷組織的顏色和狀態(tài)看，MS和改良MS效果最好，大多為淡綠色，質(zhì)地較松散;而WPM培養(yǎng)基的愈傷組織部分出現(xiàn)褐色，質(zhì)地較硬。

蔗糖是大多數(shù)植物細胞生長的最適碳源，它的吸收和利用直接影響細胞生長和產(chǎn)物合成。在B5培養(yǎng)基中添加2%的蔗糖最適合東北紅豆杉愈傷組織增殖，愈傷組織長勢旺盛。以不同質(zhì)量濃度蔗糖作為碳源進行茶細胞培養(yǎng)時，隨著蔗糖含量的增加，愈傷組織生長逐漸上升，到6%時生長最好，隨后下降［8］。本實驗結(jié)果顯示，蔗糖質(zhì)量濃度對青錢柳愈傷組織生長亦有明顯的影響，質(zhì)量濃度為20 g/L時效果最佳，增長率達175.47%;隨著蔗糖質(zhì)量濃度的增大愈傷組織生長量的增量和增長率明顯下降，分析原因可能是高質(zhì)量濃度蔗糖引起了培養(yǎng)基高滲，影響細胞的生長。這與李毅［9］的蔗糖質(zhì)量濃度大小與愈傷組織增長量成正比的結(jié)論不同。

各種植物激素質(zhì)量濃度及配比對愈傷組織增殖及繼代時的狀態(tài)、褐化起一定的促進作用。王立強［10］報道，愈傷組織繼代時高質(zhì)量濃度生長素使組織松散極易褐化，繼代后難以存活，甚至有時呈爛泥狀;高質(zhì)量濃度分裂素使愈傷組織結(jié)構(gòu)致密，繼代時不易褐化死亡。并發(fā)現(xiàn)組合KT0.5mg/L+2，4－D 0.5 mg/L繼代苦豆子愈傷組織效果最好。本實驗結(jié)果顯示，不同植物激素質(zhì)量濃度及配比對青錢柳愈傷組織的增殖有明顯的差別。其中組合KT0.2 mg/L+2，4－D0.2 mg/L 效果最佳，平均增量和增長率都達到最高，且顏色鮮嫩，結(jié)構(gòu)緊密呈顆粒狀，適于繼代培養(yǎng)。

稀土元素在植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域已有廣泛的應(yīng)用。低質(zhì)量濃度時可促進愈傷組織生長，高質(zhì)量濃度時抑制生長，更高質(zhì)量濃度時則使植物死亡，其作用與激素有許多相似之處［11］。魯寬科［12］等以藥用植物大黃的愈傷組織為研究對象，研究不同質(zhì)量濃度的稀土元素Eu對愈傷組織生長的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低質(zhì)量濃度稀土元素Eu促進愈傷組織生長.高質(zhì)量濃度則抑制生長。杜紅梅等［13］報道，在培養(yǎng)基中添加1～100 mg/L La(NO3)3明顯影響外植體的分化率、增殖倍數(shù)、幼苗的根數(shù)以及根系和莖葉中干物質(zhì)的積累，其中1 mg/L La(NO3)3處理效果最佳;而高質(zhì)量濃度(50～100 mg/L)La(NO3)3處理則顯著降低了外植體的分化率和增殖倍數(shù)。本研究表明，培養(yǎng)基中添加適宜質(zhì)量濃度(0.5 mg/L)的鑭稀土后，愈傷組織的生長得到有效促進。但難度過高則對愈傷組織生長起抑制作用，可能是由于代謝物的積累增加，使愈傷組織褐化而抑制生長，有關(guān)機制尚待進一步研究。

［1］方升佐，洑香香.青錢柳資源培育與開發(fā)利用的研究進展［J］.南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2007，31(1):95－100.

［2］謝明勇，謝建華.青錢柳研究進展［J］.食品與生物技術(shù)學(xué)報，2008，27(1):113－121.

［3］徐慶，宋蕓娟.青錢柳的研究概況［J］.華夏醫(yī)學(xué)，2004，6(3):451－453.

［4］鞏振輝，申書興.植物組織培養(yǎng)［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2007.

［5］張志敏，張穎穎，謝寅峰，等.青錢柳愈傷組織誘導(dǎo)［J］.東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2011，39(9):15－18.

［6］上官新晨，郭春蘭，楊武英，等.培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件對青錢柳愈傷組織生長和黃酮含量的影響［J］.福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2006，35(6):588－592.

［7］尚旭嵐，徐錫增，方升佐.青錢柳離體胚的培養(yǎng)及快速繁殖［J］.南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2007，31(1):101－105.

［8］郭勇，崔堂兵，謝秀禎.植物細胞培養(yǎng)技術(shù)與應(yīng)用［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2003.

［9］李毅，邸利，張國翰.常溫條件下三倍體毛白楊的愈傷組織誘導(dǎo)和保存［J］.植物生理學(xué)通訊，2002，38(6)551－553.

［10］王立強，楊軍，王光碧，等.苦豆子愈傷組織的誘導(dǎo)與繼代培養(yǎng)的去褐化研究［J］.西華師范大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2008，29(4):421－425.

［11］陳穎，謝寅峰，曹福亮.稀土在組織及細胞培養(yǎng)中的應(yīng)用研究進展［J］.福建林學(xué)院學(xué)報，2003，23(4):380－384.

［12］魯寬科，常振站，陳寶衛(wèi)，等.稀土元素對植物的激素樣作用［J］.北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1997，29(14):289－293.

［13］杜紅梅，張效平.稀土元素對春菊組培苗增殖及其干物質(zhì)分配的影響［J］.上海交通大學(xué)學(xué)報:農(nóng)業(yè)科學(xué)版，2001，19(2):102－104.