蘇小霞 盧寶偉

(黑龍江省生態(tài)工程職業(yè)學院，哈爾濱，150025)

安鳳霞

(黑龍江省科學院自然與生態(tài)研究所)

番茄(Lycopersicon esculentum)原產(chǎn)南美西部高原，是茄科的一種重要作物[1]，在世界各地可作為園林觀賞植物廣泛種植。在全球溫室效應逐年加劇的情況下[2]，對番茄耐熱性的研究顯得尤其重要。一方面是因為番茄作為一種重要的園藝作物，一直是育種的重點研究對象;另一方面是由于番茄作為一種模式植物，在生理生化、遺傳及分子生物學方面得到了比其它園藝作物更廣泛、更深入、更系統(tǒng)的研究結(jié)果。文中對番茄耐熱性遺傳規(guī)律進行了深入的探尋，旨在培育出耐熱性強的番茄品種，這有利于加強豐產(chǎn)性與耐熱性相結(jié)合的研究，從而滿足市場與生產(chǎn)的需求[3]。

本試驗采用40℃作為高溫脅迫條件，對6份番茄親本材料進行高溫處理，測定處理后的番茄幼苗熱害指數(shù)、葉片質(zhì)膜透性、游離脯氨酸質(zhì)量分數(shù)和超氧化物歧化酶活性等各項指標，并對測定結(jié)果進行方差分析。通過耐熱特性分析，鑒定并分析所用的番茄親本材料耐熱性的差異，并進一步明確試驗材料的可用性，確定是否可用于耐熱性遺傳分析。

1 材料與方法

試驗材料:番茄品種為CLN2001A、CLN2418A、CLN2366A、01241、01143 和 01137。

熱害指數(shù)測定:取20 d苗齡的同葉齡小苗，分3次重復，置于光照培養(yǎng)箱中，設(shè)置每天18 h、30℃，6 h、40℃及12 h、4000 lx光照條件，處理72 h后調(diào)查小苗熱害指數(shù)[4]。分級標準為:0級——無熱害癥狀;1級——1～2片葉變黃;2級——全部葉變黃;3級——1～2片葉萎蔫;4級——整株萎蔫枯死。熱害指數(shù)(%)=Σ(各級株數(shù)×級數(shù))/(最高級數(shù)×總株數(shù))×100[5]。

質(zhì)膜透性測定:幼苗培養(yǎng)及處理——取在室溫下培養(yǎng)的苗齡為四葉一心的同齡幼苗，分3次重復，置于光照培養(yǎng)箱中于40℃、4000 lx光照條件下處理8 h。電解質(zhì)滲透率的測定——在相同部位用直徑1 cm打孔器打取小圓片5片，加15 mL蒸餾水，振蕩30 min，用DDS－11A型電導儀測電導率(EC0)，然后在45℃恒溫水浴中處理30 min，測定EC1，最后置于100℃水浴中處理5 min，冷卻后測定。電解質(zhì)滲透率(%)=(EC1－EC0)/(EC2－EC0)×100。

游離脯氨酸質(zhì)量分數(shù)測定:幼苗培養(yǎng)及處理——同質(zhì)膜透性測定。標準曲線的繪制——配制質(zhì)量濃度為10～100 mg/L 10個系列脯氨酸標準溶液。取標準溶液各2 mL，加入2 mL 3%磺基水楊酸、2 mL冰醋酸和4 mL 2.5%酸性茚酸酮溶液，置于沸水浴中顯色60 min。冷卻后，加入4 mL甲苯萃取紅色物質(zhì)。靜置后，取甲苯相測定520 nm波長處吸收值，依據(jù)脯氨酸質(zhì)量分數(shù)和相應吸收值繪制標準曲線[6]。

脯氨酸提取:取0.5 g番茄葉片，用3%磺基水楊酸溶液研磨提取，制成終體積為5 mL的磺基水楊酸勻漿提取液，再將勻漿提取液轉(zhuǎn)入玻璃離心管中，在沸水浴中浸提10 min。冷卻后，以3000 r/min離心10 min，取上清液待測。

樣品測定:取2 mL上清液，加入2 mL水，再加入2 mL冰乙酸和4 mL 2.5%酸性茚酸酮溶液，同標準曲線程序進行顯色、萃取和比色。

SOD酶活性測定:幼苗培養(yǎng)及處理——同質(zhì)膜透性測定。酶液的制備——取0.5 g同層次相同部位的番茄葉片，加入5倍于樣品量的50 mmol/L pH7.8 磷酸緩沖液[含 0.1 mmol/L EDTA、0.3%(w/v)TritonX－100、4%(w/v)聚乙烯聚吡咯烷酮]，研磨后以紗布過濾，并以10500 r/mim離心20 min，上清液為粗酶液。酶活性測定——在盛有3 mL反應混合液(在54 mL 14.5 mmol/L dl－甲硫氨酸中分別加入 50 mmol/L pH7.8磷酸緩沖液配制的 3 μmol/L EDTA、2.25 mmol/L NBT 和60 μmol/L 核黃素各2 mL，各個溶液均在用前配制，避光放置)的試管中，加入適量的SOD粗酶液，混合后放在透明試管架上，在光照培養(yǎng)箱內(nèi)照光10 min，取出試管，迅速測定OD560值，以不加酶液的照光管為對照。計算方法——按照 McCord和 Fridovidch初次測定SOD活性時的設(shè)計，并以能抑制反應50%的酶量為一個 SOD 酶單位計算活性[7－8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄親本材料熱害指數(shù)

在人工模擬高溫脅迫下，番茄親本材料幼苗的熱害指數(shù)測定結(jié)果見表1。由表1可以看出，不同番茄品種幼苗經(jīng)高溫處理后，其受熱害程度存在顯著差異。品種CLN2001A、CLN2418A、和CLN2366A與其它品種相比，在受高溫脅迫后葉片變黃、出現(xiàn)萎蔫癥狀的速度較慢，熱害指數(shù)較低，忍耐高溫的能力強，即3個品種對高溫的忍受能力顯著高于其它品種，達到極顯著水平，且這3個品種間不存在差異，可將其歸為一類;在高溫脅迫下，01241熱害指數(shù)與其它品種存在顯著差異，在高溫下出現(xiàn)熱害癥狀的速度明顯快于CLN2001A、CLN2418A和CLN2366A 3個品種，受熱害的程度重于上述3個品種，忍受高溫脅迫的能力較強，處于中間位置;在高溫處理后，01143和01137的葉片迅速出現(xiàn)萎蔫發(fā)黃的癥狀，熱害指數(shù)與其它品種相比顯著增加，幼苗忍受高溫的能力明顯低于其它品種。由此可見，通過對經(jīng)高溫脅迫后各番茄材料熱害指數(shù)的分析，可將上述6個品種忍受高溫的能力劃分為3類，即CLN2001A、CLN2418A和CLN2366A品種忍受高溫的能力最強，耐熱性強，為耐熱材料，記作 R型;其次為01241，耐熱性較強，為較耐熱材料，記作S型;01143和01137忍受高溫的能力最弱，耐熱性最弱，為不耐熱材料，記作T型。應用熱害指數(shù)對供試番茄品種進行耐熱性分析，可初步反映材料的耐熱性，且劃分結(jié)果具有較強的可靠性。

表1 幼苗熱害指數(shù)測定結(jié)果

2.2 高溫脅迫下番茄親本材料質(zhì)膜透性

表2是對供試番茄材料進行的質(zhì)膜透性差異顯著性分析，以相對電解質(zhì)滲透率作為熱脅迫下番茄葉片質(zhì)膜透性的測定指標。與上述分析比較，二者所得結(jié)論一致。為進一步對試驗試材的耐熱特性做出更加準確的判斷，劃分出正確的耐熱型，得到適合用于遺傳分析且耐熱性存在顯著差異的番茄品種，仍需選擇其它生理指標對供試材料進行正確判別。

表2 高溫處理后不同番茄品種相對電解質(zhì)滲透率

2.3 高溫脅迫下番茄親本材料游離脯氨酸質(zhì)量分數(shù)

由高溫處理后不同番茄品種游離脯氨酸質(zhì)量分數(shù)的差異顯著性分析(表3)可知，游離脯氨酸質(zhì)量分數(shù)存在顯著差異。由此可見，供試的番茄親本材料可用于耐熱性遺傳分析，游離脯氨酸質(zhì)量分數(shù)的差異分析與熱害指數(shù)分析及質(zhì)膜透性的鑒定結(jié)論相一致。此外，由于超氧化物歧化酶活性也是植物抗逆性分析的一個重要的理化指標，在對植物進行更加細致的抗逆性能鑒定時，此項指標具有較強的說服力。

2.4 高溫脅迫后番茄親本材料超氧化物歧化酶活性

從表3和表4中可以看出，在經(jīng)8 h、40℃的高溫脅迫后，各番茄品種幼苗葉片中的超氧化物歧化酶(SOD)活性出現(xiàn)顯著差異。SOD是一切需氧有機體中普遍存在的一種酶。許多研究證實，該酶能消除超氧化物自由基，控制膜的過氧化水平，在減輕膜的傷害上起著一種保護作用[9]。因此，用SOD酶活性對供試材料進行耐熱性分析得到如下結(jié)論:在6份試驗材料中，CLN2001A、CLN2418A 和CLN2366A番茄品種的酶活性，即自身細胞膜免受高溫傷害的能力均極顯著地高于其它品種，耐熱性強，屬于耐熱類型，記作R型;品種01241在高溫下酶的活性顯著高于01143和01137兩份材料，屬于較耐熱品種，記作S型;01143和01137二者在高溫脅迫后，其SOD酶活性均極顯著地低于其它供試番茄材料，耐熱性差，記作T型。

表3 高溫處理后不同品種游離脯氨酸質(zhì)量分數(shù)

表4 高溫處理后不同品種超氧化物歧化酶活性

3 結(jié)論

通過對6份供試材料熱害指數(shù)、游離脯氨酸質(zhì)量分數(shù)、質(zhì)膜透性和超氧化物歧化酶活性等指標的測定，分析得到耐熱性不同的供試番茄品種幼苗在經(jīng)高溫處理后，其忍受高溫傷害的能力存在極顯著差異，耐熱性分析所得結(jié)論一致，進而證實供試材料的耐熱型劃分準確可靠，試材可用于遺傳分析，且劃分的耐熱型結(jié)果無差異，即各耐熱型均為:品種CLN2001A、CLN2418A和 CLN2366A為 R型(耐熱);品種01241為S型(較耐熱);01143和01137為T型(不耐熱)。在進行抗性遺傳分析時，最關(guān)鍵的是選擇正確的供試親本材料[10－11]，即抗性存在極顯著差異的試材，只有這樣才能進行抗逆遺傳特性分析[12－13]。本試驗所采用的親本材料耐熱性存在極顯著的差異，證實親本遺傳型對耐熱性存在著真實穩(wěn)定的差異，因此，R、S和T型的劃分是合理的，試材可用于遺傳分析。

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