王曉楊 毛宇飛 王萬(wàn)鐵 郝茂林 張 波

(金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，浙江 金華 321000)

組織缺血再灌注(IR)時(shí)可觀察到細(xì)胞凋亡的發(fā)生〔1，2〕，并認(rèn)為細(xì)胞凋亡可能是心臟IR損傷發(fā)生的重要機(jī)制之一〔3〕。川芎嗪(TMP)對(duì)大鼠IR視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激水平及細(xì)胞凋亡有重要的影響〔4〕。本課題探討肺IR損傷中氧化應(yīng)激與細(xì)胞凋亡的關(guān)系，并探討川芎嗪對(duì)其的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 細(xì)胞凋亡試劑:原位末端標(biāo)記試劑盒 (3%H2O2、Labelling緩沖液)、Tris鹽酸緩沖液(TBS)、封閉液生物素化抗地高辛抗體、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑等(武漢博士德公司提供)。川芎嗪注射液(批號(hào)03041711:山東長(zhǎng)富潔凈藥業(yè)有限公司提供)。丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒由南京建成生物工程公司提供。

1.1.2 動(dòng)物 由溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供健康清潔級(jí)日本大耳白兔60只，體重2.5～3.0 kg，雌、雄不拘。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及方法 隨機(jī)分為三組，每組30只:(1)假手術(shù)組。(2)IR組，再分三個(gè)亞組，每個(gè)亞組10只，開胸后左肺門阻斷1 h，分別開放接受1、3、5 h的再灌注，于缺血前60 min靜脈滴注與川芎嗪等量的生理鹽水。(3)川芎嗪干預(yù)組(TMP組)，于缺血前60 min靜脈滴注川芎嗪60 mg/kg，其余操作同IR組。

1.2.2 模型制備 經(jīng)兔耳緣靜脈注射20%烏拉坦5 mg/kg，麻醉后仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)。頸部正中切口，分離左頸外靜脈并插管，生理鹽水0.5～1.5 ml/min靜滴維持;左頸總動(dòng)脈插管，接肝素化三通管;氣管切開插管，接動(dòng)物呼吸機(jī)輔助呼吸，吸氧濃度100%，呼吸頻率30～40次/min，潮氣量雙側(cè)肺通氣15～20 ml/kg，單側(cè)8～10 ml/kg。沿胸骨左緣切斷第3、4、5肋骨開胸，離斷左側(cè)肺下韌帶，游離左肺門穿過(guò)阻斷帶備用，頸外靜脈注射肝素1 mg/kg抗凝。按Sekido等〔5〕報(bào)道的方法復(fù)制在體兔IR模型，即在呼氣末于左肺門處用阻斷帶結(jié)扎左側(cè)肺動(dòng)脈、肺靜脈及左主支氣管，終止左肺血供為左肺缺血持續(xù)1 h;開放恢復(fù)供血和通氣為左肺再灌注。

1.2.3 血液指標(biāo)測(cè)定 缺血1 h或術(shù)后1 h，再灌注1、3、5 h，從頸總動(dòng)脈取血。3 500 r/min低溫離心15 min，取血清檢測(cè)下列指標(biāo):①血漿MDA含量:采用硫代巴比妥酸法，采用721分光光度計(jì)，在532 nm處比色測(cè)定。②血漿SOD活力:采用黃嘌呤氧化酶法，用721分光光度計(jì)在550 nm處比色測(cè)定。

1.2.4 標(biāo)本的采集及處理 分別于再灌注1、3、5 h各時(shí)限點(diǎn)留取左肺標(biāo)本，部分標(biāo)本置于10%甲醛中固定，常規(guī)組織學(xué)處理、石蠟包埋切片;部分標(biāo)本置液氮中，后放在-70℃冰箱中凍存待測(cè)。

1.2.5 觀察指標(biāo) 肺細(xì)胞凋亡的檢測(cè)采用原位末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)，按TUNEL檢測(cè)試劑盒的使用說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.6 判定標(biāo)準(zhǔn) 在光學(xué)顯微鏡下觀察TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，細(xì)胞核染色呈棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞，即為發(fā)生凋亡的細(xì)胞。

1.2.7 肺組織細(xì)胞凋亡分析 于各組切片中任意抽取其中一張切片，采用目測(cè)半定量法分析結(jié)果，凋亡指數(shù)計(jì)算方法〔6〕:在高倍視野(×400)下，選擇5個(gè)視野，分別計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞和總細(xì)胞數(shù)。計(jì)算細(xì)胞凋亡陽(yáng)性個(gè)數(shù)，用細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)表示。AI=(凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以±s表示，兩組之間比較用t檢驗(yàn)，單因素方差分析用于多組均數(shù)顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組總血漿SOD活力比較 IR組的SOD活力在再灌注1、3、5 h與假手術(shù)組比較顯著降低(均P＜0.05)，TMP組在缺血1 h再灌注1、3、5 h SOD活力與IR組比較明顯升高(均P＜0.01)，且TMP組在再灌注1、3、5 h與假手術(shù)組比較SOD活力明顯升高(均P＜0.01)。見(jiàn)表1。

2.2 各組兔血漿MDA含量比較 在缺血1 h再灌注1、3、5 h，IR組與假手術(shù)組比較MDA含量顯著增高(P＜0.01);TMP組在缺血后再灌注1、3、5 h的MDA含量顯著高于假手術(shù)組(P＜0.05，P＜0.01)，但卻顯著低于 IR 組(P＜0.05，P＜0.01)。見(jiàn)表2。

2.3 肺組織細(xì)胞AI IR組及TMP組缺血后再灌注1、3、5 h均可見(jiàn)肺組織細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，但TMP組再灌注同時(shí)相點(diǎn)的肺組織細(xì)胞凋亡數(shù)顯著減少(P＜0.01);兩組中3 h組凋亡細(xì)胞數(shù)均明顯高于1 h與5 h組(P＜0.01)。采用Pearson法進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，AI與 MDA含量呈正相關(guān)(r=0.764，P＜0.05)，與SOD活力呈負(fù)相關(guān)(r=-0.665，P＜0.05)。見(jiàn)表3，圖1。

表1 兔血漿SOD活力(NU/ml，±s，n=10)

表1 兔血漿SOD活力(NU/ml，±s，n=10)

與假手術(shù)組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與IR組比較:3)P＜0.01

組別1 h 3 h 5 h假手術(shù)組109.19±11.04 108.17±10.34 108.28±10.16 IR組 97.74.11±6.671) 99.30±11.281) 97.16±9.581)TMP組 112.15±7.92)3) 125.00±0.432)3) 120.13±7.992)3)

表2 兔血漿MDA含量(nmol/ml，±s，n=10)

表2 兔血漿MDA含量(nmol/ml，±s，n=10)

與假手術(shù)組比較:1)P＜0.01;與IR組比較:2)P＜0.05，3)P＜0.01

組別1 h 3 h 5 h假手術(shù)組1.61±0.34 1.76±0.38 1.72±0.23 IR組 4.20±0.641) 4.28±0.471) 4.28±0.831)TMP組 2.11±0.761)3) 2.24±0.721)2) 2.42±0.921)2)

表3 各組肺組織細(xì)胞AI指數(shù)比較(±s，n=10)

表3 各組肺組織細(xì)胞AI指數(shù)比較(±s，n=10)

與IR組比較:1)P＜0.01;與再灌注1 h和5 h組比較:2)P＜0.01

組別1 h 3 h 5 h假手術(shù)組0.60±0.74 0.61±0.64 0.62±0.72 IR組 14.9±1.911) 32.43 ±5.831)2) 18.72±2.251)TMP組 7.9±2.231)2) 22.40±3.021)2) 11.32±2.321)2)

圖1 各組光鏡下肺組織細(xì)胞凋亡情況(×400)

3 討論

細(xì)胞凋亡是在基因控制下的自主有序的細(xì)胞死亡，在維持細(xì)胞群體數(shù)量穩(wěn)定及功能方面具有重要的作用，組織器官大量的細(xì)胞凋亡能夠引起該器官的功能明顯降低。本研究表明肺IR過(guò)程可引起肺細(xì)胞凋亡率顯著升高，與Fischer等〔7，8〕等研究結(jié)果一致。肺IR細(xì)胞凋亡與氧化應(yīng)激具有一定的相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)表明川芎嗪具有拮抗肺IR過(guò)程中細(xì)胞凋亡的作用，并且川芎嗪具有減輕肺IR損傷產(chǎn)生的氧自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的作用。由自由基引發(fā)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，導(dǎo)致生物膜上多聚不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)而引起生物膜結(jié)構(gòu)的破壞。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，是反映脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的指標(biāo)，同時(shí)也是自由基損傷的指標(biāo)〔9〕。自由基還可以直接導(dǎo)致蛋白質(zhì)、核酸、多糖的結(jié)構(gòu)和功能受損〔10〕，這可能是肺IR過(guò)程中導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的主要機(jī)制之一。SOD為內(nèi)源性的氧自由基清除機(jī)劑之一，催化超氧陰離子(O-2)轉(zhuǎn)化為H2O。氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA與AI呈正相關(guān)，SOD可拮抗自由基的形成，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而抑制減緩細(xì)胞凋亡的發(fā)生，故與AI呈負(fù)相關(guān)。該實(shí)驗(yàn)表明川芎嗪可抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)所致的自由基大量形成，從而減輕肺組織細(xì)胞凋亡，減輕由氧化應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞凋亡而引起的肺IR損傷。

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