張躍新，閆寶松，馬鳳，胡偉

（黑龍江省林副特產(chǎn)研究所，黑龍江省非木質(zhì)林產(chǎn)品研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 牡丹江157011）

亞側(cè)耳（Hohenbuehelia serotina）［1－2］商品名元蘑，又名凍蘑，是黑龍江省特有的山珍之一。亞側(cè)耳肉質(zhì)細(xì)膩，柔嫩鮮美，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高，含有人體所需的多種氨基酸、維生素和微量元素，經(jīng)常食用具有加強(qiáng)肌體免疫，增強(qiáng)機(jī)體抵抗能力，益智開(kāi)心，益氣不饑，延年輕身等作用。

RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA）技術(shù)，是Williams和Welsh等1990年發(fā)明的一種新型DNA分子標(biāo)記技術(shù)，該技術(shù)具有簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、靈敏度高和多態(tài)性豐富等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位和遺傳多樣性的檢測(cè)［3］。本文在參考一般食用菌RAPD試驗(yàn)的基礎(chǔ)上［4－5］，建立了亞側(cè)耳 RAPD基本反應(yīng)體系，并對(duì)基本反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化，為亞側(cè)耳種質(zhì)資源遺傳多樣性的RAPD分析奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

亞側(cè)耳3號(hào)，為黑龍江省林副特產(chǎn)研究所培育菌株。

1.1.2 試劑

隨機(jī)引物購(gòu)自上海生工，基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司，Taq酶及相配套的反應(yīng)緩沖液購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2 亞側(cè)耳基因組DNA提取

采用天根生化科技有限公司的“快捷型植物基因組提取試劑盒”進(jìn)行DNA提取。

1.3 亞側(cè)耳RAPD反應(yīng)體系設(shè)計(jì)

1.3.1 基本反應(yīng)體系及基本反應(yīng)條件

表1 基本反應(yīng)體系（25μl體系）

基本反應(yīng)程序

1.3.2 各反應(yīng)因素梯度設(shè)計(jì)

表2 各反應(yīng)因素梯度設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 亞側(cè)耳模版DNA提取結(jié)果

將提取的亞側(cè)耳DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳（圖1）。DNA呈現(xiàn)出一條明亮的譜帶且無(wú)明顯的拖尾現(xiàn)象，說(shuō)明所提取的DNA比較完整，質(zhì)量較高，可用于RAPD分析。

2.2 引物濃度優(yōu)化結(jié)果

經(jīng)引物篩選試驗(yàn)，在100個(gè)隨機(jī)引物中篩選出S167、S467、S475、S460四個(gè)引物，其中引物以S167擴(kuò)增效果最好，因此選用S167進(jìn)行RAPD反應(yīng)體系構(gòu)建。在引物濃度優(yōu)化試驗(yàn)中（圖2）可知，5個(gè)引物濃度梯度中，除1號(hào)外，其它梯度擴(kuò)增效果多態(tài)性均非常豐富，且條帶清晰。因此，出于成本考慮，選擇2號(hào)為最佳引物濃度，即25μL反應(yīng)體系中添加1.5μL引物。

圖1 亞側(cè)耳DNA電泳結(jié)果

圖2 引物濃度優(yōu)化試驗(yàn)

2.3 模版DNA濃度優(yōu)化結(jié)果

模版DNA濃度優(yōu)化結(jié)果如圖3，其中1號(hào)、2號(hào)擴(kuò)增條帶不清晰，擴(kuò)增效果不好；3號(hào)、4號(hào)、5號(hào)擴(kuò)增條帶清晰，且呈多態(tài)性，出于成本考慮，選擇3號(hào)濃度，即25μL反應(yīng)體系中添加2.0μL模版DNA。

圖3 模版DNA濃度優(yōu)化試驗(yàn)

2.4 Taq酶濃度優(yōu)化結(jié)果

Taq酶濃度優(yōu)化結(jié)果如圖4，各濃度條帶均比較清晰，且多態(tài)性豐富，其中以2號(hào)、3號(hào)濃度條件下最為清晰，出于成本考慮，選擇2號(hào)濃度，即25μL反應(yīng)體系中添加0.2μL Taq酶。

圖4 Taq酶濃度優(yōu)化試驗(yàn)

2.5 10×PCR Buffer濃度優(yōu)化結(jié)果

10×PCR Buffer濃度優(yōu)化結(jié)果如圖5，以2號(hào)濃度最為清晰，因此25μL反應(yīng)體系中添加2.0μL10×PCR Buffer溶液。

圖5 10×PCR Buffer濃度優(yōu)化試驗(yàn)

2.6 dNTP濃度優(yōu)化結(jié)果

圖6 dNTP濃度優(yōu)化試驗(yàn)

dNTP濃度優(yōu)化如圖6，其中1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)濃度條件下擴(kuò)增效果均比較清晰，且條帶呈多態(tài)性，其中1號(hào)濃度條件下擴(kuò)增效果最為清晰，因此25μL反應(yīng)體系中添加3.0μL dNTP溶液。

3 結(jié)論

在RAPD反應(yīng)中，影響PCR反應(yīng)的因素很多，其中包括PCR緩沖液、dNTP的濃度、循環(huán)參數(shù)（退火溫度、變溫時(shí)間、PCR儀），Taq DNA聚合酶的來(lái)源及型號(hào)、模板DNA的質(zhì)量和含量、引物純度及濃度、DNA污染的共抽提和擴(kuò)增干擾等。本文對(duì)RAPD反應(yīng)體系中的10×PCR Buffer濃度 、dNTP濃度、模板DNA濃度、引物濃度、Taq酶濃度這5個(gè)主要影響因素進(jìn)行了優(yōu)化，最終確立了亞側(cè)耳RAPD－PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序。反應(yīng)體系（25μL）：10×PCR Buffer 2.0μL、2.5mM／L dNTPs3.0μL、5U／μL Taq酶0.20μL、5μM／L引物1.5μL、200ng／μL模板 DNA 2.0μL、去離子水16.30μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，37℃退火30s，72℃延伸2min，40個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min，4℃forever。

［1］ 戴芳瀾.中國(guó)真菌總匯［M］.科學(xué)出版社，1979.

［2］ Liu Y，Bau Tolgor.A new species of Hohenbuehelia from China［J］.Mycotaxon.2009.

［3］ 劉明，王繼華.DNA分子標(biāo)記技術(shù).東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，31，（6）：65－67.

［4］ 李三署，林新堅(jiān).姬松茸和雙胞蘑菇不同菌株的RAPD擴(kuò)增研究［J］.食用菌學(xué)報(bào)，2002，9（3）：1－4.

［5］ 詹才新，朱蘭寶.RAPD技術(shù)在金針菇雜交育種中的應(yīng)用［J］.食用菌學(xué)報(bào)，1995，2（1）：7－11.