陶月 寧明哲 張葵 張之烽

22株耐亞胺培南腸桿菌科細菌KPC酶及整合子分布

陶月 寧明哲 張葵 張之烽

目的了解耐亞胺培南的腸桿菌科細菌KPC酶(klebsiella pneumoniae carbapenemase)及整合子分布情況。方法收集南京市鼓樓醫(yī)院22株耐亞胺培南的腸桿菌科細菌，進行改良Hodge試驗，PCR擴增檢測細菌KPC酶與整合子基因并行序列分析。結(jié)果22株腸桿菌科細菌中，改良Hodge試驗陽性15株(68．2%)，KPC酶擴增陽性15株(68．2%)，整合子PCR擴增陽性6株(27．3%)。結(jié)論KPC酶的流行需引起實驗室及臨床的關(guān)注。

腸桿菌科細菌KPC酶整合子

碳青霉烯類藥物是臨床治療革蘭陰性桿菌感染的最有效藥物之一，它可用于治療產(chǎn)超廣譜β－內(nèi)酰胺酶(ESBLs)及AmpC酶等多重耐藥菌引起的感染，包括亞胺培南、美羅培南和厄他培南等。但隨著其廣泛使用，耐藥菌株也隨之出現(xiàn)。先是在鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌等非發(fā)酵菌中出現(xiàn)對碳青霉烯類藥物耐藥的細菌，而產(chǎn)KPC酶的肺炎克雷伯菌于2001年在美國北卡羅來納州首次被發(fā)現(xiàn)，之后數(shù)年間，產(chǎn)KPC酶菌株已在美國各州蔓延，且在多種腸桿菌科細菌中均有報道［1］。2010年4月，筆者醫(yī)院首次檢出出現(xiàn)耐亞胺培南的肺炎克雷伯菌，至2011年6月共出現(xiàn)22株耐亞胺培南的腸桿菌科細菌。現(xiàn)對該22株菌進行改良Hodge實驗、KPC酶及整合子基因檢測。

材料與方法

1．菌株來源:收集南京市鼓樓醫(yī)院2010年4月～2011年4月臨床分離的耐亞胺培南的腸桿菌科細菌共22株。

2．鑒定方法:全部菌株均使用法國生物－梅里埃公司ATB鑒定系統(tǒng)進行鑒定。質(zhì)控菌株為大腸桿菌ATCC25922，金黃色葡萄球菌ATCC25923，銅綠假單胞菌ATCC27853。

3．藥敏試驗:細菌采用紙片擴散(K－B)法，結(jié)果按CLSI2010年版標準判定。藥敏紙片均購自英國Oxiod公司。質(zhì)控菌的試驗結(jié)果均在CLSI規(guī)定范圍內(nèi)。

4．試劑:PCR引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，Taq酶購自日本Takara公司，凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio－Rad公司)，普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒(北京天根生化科技有限公司)。

5．改良Hodge試驗:將0．5麥氏濁度單位的大腸桿菌ATCC25922菌液均勻涂布在MH平板上，中間貼美羅培南(10μg)紙片，將實驗菌株以美羅培南紙片為起點，用無菌接種環(huán)自紙片外緣向平板邊緣以離心方向劃線，以肺炎克雷伯菌ATCC1705為陽性對照，肺炎克雷伯菌ATCC1706為陰性對照，35℃培養(yǎng)16～18h后觀察結(jié)果，美羅培南抑菌圈內(nèi)出現(xiàn)待檢菌矢狀生長者為陽性。陽性表明產(chǎn)KPC酶，見圖1。

圖1 改良Hodge實驗結(jié)果

6．耐藥基因檢測:(1)模板和引物:加熱煮沸法制備DNA模板，參考文獻合成KPC酶基因引物，引物F:5'－GCTACACCTAGCTCCACCTTC－3';引物R:5'－ACAGTGGTTGGTAATCCATGC－3'。根據(jù)文獻設(shè)計可同時檢測Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅲ類整合子的整合酶基因(intI1、intI2和intI3)的簡并引物，引物1:5'－TGCGGGTYAARGATBTKGATTT－3';引物2:5'－CARCACATGCGTRTA RAT－3'［2～4］。(2)耐藥基因PCR:KPC酶50μl反應(yīng)體系含10×PCR Buffer 5μl，Mg2+4μl，dNTP (2.5mmol/L)4μl，TaqDNA聚合酶0．5μl，引物各1μl (10μmol/L)，DNA模板2μl，滅菌雙蒸水補足體積。反應(yīng)條件:94℃預變性5min;94℃45s、55℃40s、72℃70s，共35個循環(huán);72℃延伸5min。目的條帶920bp。整合酶25μl反應(yīng)體系含10×PCR Buffer 2．5μl，Mg2+2．5μl，dNTP(2．5mmol/L)2μl，TaqDNA聚合酶0．5μl，引物各1μl(10μmol/L)，DNA模板2μl，滅菌雙蒸水補足體積。反應(yīng)條件:95℃預變性5min;94℃30s、50℃40s、72℃40s，共35個循環(huán);72℃延伸10min。目的條帶491bp。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1．5%瓊脂糖凝膠電泳120V 20min，凝膠成像系統(tǒng)成像，觀察記錄結(jié)果。陽性產(chǎn)物經(jīng)純化后用HITACHI 3130測序儀測序，所得DNA序列用BLAST程序與GenBank中的NR數(shù)據(jù)庫進行在線比對。

結(jié)果

1．菌株構(gòu)成:收集的22株待檢菌中，有肺炎克雷伯菌14株(63．6%)，大腸桿菌5株(22．8%)，產(chǎn)酸克雷伯菌、陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌各1株(各占4.5%)。

2．實驗結(jié)果:22株待檢菌中，改良Hodge實驗陽性菌有15例(68．2%)，KPC基因檢測陽性有15例(68．2%)，整合子檢測陽性有6例(27．3%)。KPC擴增產(chǎn)物進行測序比對，均為KPC－2型(圖2)。15株肺炎克雷伯菌中，改良Hodge實驗與KPC基因檢測陽性菌有12例(80．0%)，整合子檢測陽性有4例(26．7%)。其他7株腸桿菌科細菌中，改良Hodge實驗與KPC基因檢測陽性有3例(20．0%)，整合子檢測陽性有2例(28．6%，圖3～圖4及表1～表3)。

表1 22株待檢菌檢測結(jié)果

表2 15株肺炎克雷伯菌改良Hodge實驗、KPC酶、整合子檢測結(jié)果分類

表3 其他7株腸桿菌科細菌改良Hodge實驗、KPC酶、整合子檢測結(jié)果分類

經(jīng)卡方檢驗，22株待檢菌中，KPC與整合子基因檢測有明顯差異(χ2=7．37，P＜0．01)，改良Hodge實驗和KPC酶基因檢測符合率為100%。而在15株肺炎克雷伯菌中KPC陽性12例(80．0%)，7株其他腸桿菌科細菌中KPC陽性3株(42．9%)，KPC陽性率在肺炎克雷伯菌與其他腸桿菌科細菌中沒有明顯差異(χ2=1．56，P＞0．05)。

討論

腸桿菌科細菌對碳青霉烯類抗生素耐藥最主要的機制是產(chǎn)生碳氫酶烯酶，以KPC酶為主。此酶可水解青霉素類、頭孢菌素類、單酰胺類和碳氫酶烯類抗生素。這種活性可被克拉維酸和他唑巴坦所抑制，但對EDTA不敏感。目前已發(fā)現(xiàn)的KPC型酶已有11種，分別從KPC－1型至KPC－11型酶［3］。據(jù)相關(guān)文獻報道，中國地區(qū)均以KPC－2型檢出率較高，國內(nèi)先后分離到產(chǎn)KPC－2型肺炎克雷伯菌，大腸桿菌，黏質(zhì)沙雷菌［4～6］。本研究中，共檢測到15株菌產(chǎn)KPC酶，經(jīng)測序亦均為KPC－2型。

2009年CLSI提出用改良Hodge實驗作為檢測碳氫酶烯酶的篩選實驗。本實驗中，改良Hodge實驗與KPC－PCR檢測結(jié)果完全吻合，未出現(xiàn)假陽性和假陰性。這次檢測的22株細菌均為對亞胺培南耐藥的腸桿菌科細菌，未出現(xiàn)中介，使得改良Hodge實驗準確度提高［7］。整合子是抗生素耐藥基因的重要存儲庫，在細菌多重耐藥機制中發(fā)揮重要作用［8］。本實驗中，整合子檢出率較低，可見整合子在耐碳青霉烯過程中并非其主要作用。本實驗耐碳青霉稀類的腸桿菌科細菌中，KPC酶檢測仍有7株為陰性，其中2株為整合子檢測陽性，余下5株可能與其他耐藥機制相關(guān):①外膜蛋白丟失合并AmpC等酶高產(chǎn)［9］;②藥物作用靶位的改變;③產(chǎn)生其他碳青霉烯酶，如IMP等。KPC酶的出現(xiàn)給腸桿菌科細菌感染的治療帶來不小的困難。如何防止其流行，加強對其監(jiān)測，是臨床和實驗室共同關(guān)注的目標。

1Yigit H，Queenan AM，Anderson GJ，et al．Novel carbapenem－h(huán)ydrolyzing beta－lactamase，KPC－1，from a carbapenem－resistant strain of Klebsiella pneumoniae［J］．Antimicrob Agents Chemother，2001，45 (4):1151－1161

2Bell JM，Turnidge JD，Wiedemann B．Role of pencillin－binding proteins in the initiation of the AmpC β－lactamase－producing Enterobacter cloacae in the Asia－Pacific region:results from the STNTRY Antimicrobial Surveillance Program，1998 to 2001［J］．Antimicrob A-gents Chemother，2003，47:3989－3993

3胡付品，朱德妹．KPC型碳氫酶烯酶研究進展［J］．中國感染與化療雜志，2011，11(1):76－80

4張幸國，杜小幸，張嶸，等．發(fā)現(xiàn)一株產(chǎn)KPC－2型碳青霉稀酶肺炎克雷伯菌［J］．中華檢驗醫(yī)學雜志，2006，29(9):824－826

5WeiZQ，Du XX，Yu YS，et al．Plasmid－mediated KPC－2 in a klebsiella pneumoniae isolate from China［J］．Antimicrob Agents Chemother，2007，51(2):763－765

6Cai JC，Zhou HW，Zhang R，et al．Emergence of Serratia marcescens，klebsiella pneumoniae，and escherichia coli isolates possessing the plasmid－mediated carbapenem－h(huán)ydrolyzing beta－lactamase KPC－2 in intensive care units of a Chinese hospital［J］Antimicrob Agents Chemother，2008 Jun，52(6):2014－2018

7施德仕，邵海楓，王衛(wèi)萍，等．用改良Hodge實驗篩查低產(chǎn)碳氫酶烯酶腸桿菌科細菌［J］．臨床檢驗雜志，2010，28(11):455－457

8Labbate M，Case RJ，Stokes HW．The integron gene cassette system: an active player in bacterial adaptation［J］．2009，532(2):103－125

9李軼，張嶸，周宏偉，等．亞胺培南耐藥大腸埃希菌的耐藥機制研究［J］．中華檢驗醫(yī)學雜志，2008，31(10):1167－1169

(收稿:2011－11－26)

(修回:2011－12－16)

Distribution of KPC and Integrons in 22 Imipenem－resistant Enterobacteriaceae．

Tao Yue，Ning Mingzhe，Zhang Kui，Zhang Zhifeng．Department of Clinical Laboratory，Drum Tower Hospital of Nanjing，Jiangsu 210008，China

ObjectiveTo investigate the distribution of KPC and integrons in imipenem－resistant Enterobacteriaceae．Methods We modified Hodge test and PCR amplification for 22 imipenem－resistant Enterobacteriaceae from Nanjing Drum Tower Hospital，detected KPC and integron of bacterial and did sequence analysis．ResultsIn 22 Enterobacteriaceae，15 strains(68．2%)were positive in the modified Hodge，15 strains(68．2%)were positive in KPC amplification，6 strains(27．3%)were positive in PCR amplification of integron．ConclusionKPC Shold be paid attention as it may to cause the prevalence of laboratory and clinical attention．

Enterobacteriaceae;KPC;Integron

南京市衛(wèi)生局資助項目(YKK09115)

210008南京市鼓樓醫(yī)院檢驗科

張葵，電子信箱:zkangkui@yahoo．com．cn