黃友澤 陸紅 白永恒 陳以勒 曾云祥 潘貽飛

維生素D受體基因型、單體型與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性研究

黃友澤 陸紅 白永恒 陳以勒 曾云祥 潘貽飛

目的探討維生素D受體(VDR)基因型、單體型與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系。方法選取146例乳腺癌患者和320例非癌女性對(duì)照人群為研究對(duì)象，應(yīng)用PCR－RFLP檢測(cè)VDR基因rs1544410、rs7975232和rs731236點(diǎn)的多態(tài)性，采用ELISA檢測(cè)血漿中1，25(OH)2D3含量，結(jié)果用SPSS 13．0軟件進(jìn)行分析。結(jié)果3個(gè)位點(diǎn)中僅rs7975232基因型與乳腺癌發(fā)病相關(guān)。與純合子GG相比，雜合子基因型TT具有較低的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(P=0．001，OR=0．460，95%CI:0．286～0．740)。但不同的基因型之間1，25 (OH)2D3含量并無差異。此外，單體型AGT在病例組分布頻率為3．8%，顯著高于對(duì)照組的分布頻率(0．8%，P=0．002);而單體型GTT在病例組的分布則顯著低于對(duì)照組(19．8%vs 26．7%，P=0．018)。結(jié)論VDR基因與乳腺癌發(fā)病存在一定相關(guān);攜帶單體型GTT的女性具有較低的患乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)，而單體型AGT則發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)較高。

維生素D受體單體型基因型乳腺癌

對(duì)象與方法

1．研究對(duì)象:收集溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院2009年3月～2010年5月住院后經(jīng)病理確診的146例乳腺癌患者，年齡分布為28～78歲，平均年齡為50．7歲。同時(shí)選取同期320例在該院進(jìn)行健康體檢的女性作為對(duì)照人群，對(duì)照人群均無相關(guān)臨床癥狀，無腫瘤和遺傳病史。對(duì)照組年齡為22～84歲，平均年齡為44．9歲。所有患者及健康對(duì)照人群均為漢族，且無血緣關(guān)系。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試對(duì)象或家屬均知情同意。

2．研究方法:(1)標(biāo)本采集、血漿分離和總DNA提取:抽取乳腺腫瘤患者和健康人群用EDTA·K2抗凝的外周血5ml，用全血DNA提取試劑盒(飛捷生物公司)提取全基因組DNA，置于－20℃保存，備用。(2)引物設(shè)計(jì)和基因分型:根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道設(shè)計(jì)引物，由上海捷瑞生物公司合成［3］。PCR反應(yīng)體系:10×EasyTaq Buffer 5μl，25mmol/L的MgCl20．5μl，各含25mmol/L的dNTP混合液0．5μl，10μmol/L的引物P1和P2各0．4μl，80～200ng DNA模板，5U/μl的EasyTaq DNA聚合酶0．25μl(TransGen Biotech)，加水至50μl。PCR退火溫度、引物序列和酶切條件見表1。隨機(jī)篩選部分樣本送公司測(cè)序進(jìn)行突變驗(yàn)證。(3)1，25(OH)2D3含量檢測(cè)采用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)血漿中1，25(OH)2D3水平，即用抗人1，25 (OH)2D3單抗包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的1，25 (OH)2D3與單抗結(jié)合，加入酶標(biāo)抗體，形成免疫復(fù)合物連接在板上，加入酶底物TMB，出現(xiàn)藍(lán)色，加終止液硫酸，顏色變黃，在450nm處測(cè)OD值。1，25(OH)2D3濃度與OD值成正比，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中1，25(OH)2D3濃度。

表1 PCR－RFLP技術(shù)分析VDR基因多態(tài)性引物和酶切條件

3．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:對(duì)照人群的3個(gè)位點(diǎn)基因型進(jìn)行Hardy－Weinberg平衡檢驗(yàn)，采用非條件Logistic回歸分析基因型、等位基因在病例對(duì)照中的分布差異;采用兩樣本t檢驗(yàn)分析不同基因型間1，25(OH)2D3含量差異。應(yīng)用SHEsis平臺(tái)評(píng)價(jià)VDR單體型分布差異，結(jié)果用P＜0．05作為判定統(tǒng)計(jì)上差異的標(biāo)準(zhǔn)［4］。

結(jié)果

1．乳腺癌和對(duì)照組VDR基因型和等位基因分布情況:圖1顯示rs1544410、rs7975232和rs731236位點(diǎn)的基因型電泳和測(cè)序結(jié)果。對(duì)照人群VDR基因3個(gè)位點(diǎn)的基因型進(jìn)行Hardy－Weinberg平衡檢驗(yàn)，檢測(cè)得到基因型的觀察值與預(yù)期值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示收集的樣本具有群體代表性。此外，研究發(fā)現(xiàn)rs731236位點(diǎn)多態(tài)性與乳腺癌相關(guān)，見表2。與野生型純合子GG相比，雜合子基因型TT在病例對(duì)照中的分布具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0．001)，經(jīng)過年齡校準(zhǔn)的OR=0．460，95%CI:0．286～0．740。

圖1 VDR基因rs1544410、rs7975232和rs731236點(diǎn)的基因型電泳圖和測(cè)序結(jié)果圖

2．VDR基因型與血漿中1，25(OH)2D3的關(guān)系:隨機(jī)挑選了90例病例組和90例對(duì)照人群檢測(cè)血漿中的1，25(OH)2D3含量，結(jié)果顯示病例組中其含量為524．83±380．45pmol/ml，明顯低于健康對(duì)照人群中1，25(OH)2D3的含量(781．45±373．05pmol/ml，P=0．041)，但不同基因型之間1，25(OH)2D3的含量則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(數(shù)據(jù)未列出)。

表2 乳腺癌和對(duì)照組VDR基因型和等位基因分布情況［n(%)］

3．VDR基因單體型分析:SHEsis軟件顯示VDR基因rs1544410、rs7975232和rs731236點(diǎn)存在較強(qiáng)連鎖不平衡現(xiàn)象。對(duì)人群進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)VDR基因以單體型GGT為主，GTT次之，而單體型AGC和GGC分布最少，如表3所示。本研究顯示單體型AGT在病例組中分布頻率為3．8%，明顯高于對(duì)照組中的分布頻率(0．8%，P=0．002);而單體型GTT在病例組中分布頻率(19．8%)則明顯低于對(duì)照組(26．7%，P= 0．002)。單體型結(jié)果提示攜帶有GTT單體型的女性具有較低的患乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)(OR=0．666)，而AGT單體型則發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)較高(OR=4．632)。

討論

活性維生素D及其衍生物在體內(nèi)對(duì)靶細(xì)胞的生理生化效應(yīng)，不僅表現(xiàn)在調(diào)節(jié)骨骼、腸道的鈣磷代謝，調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫力，同樣也表現(xiàn)在對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡的調(diào)控作用。研究顯示血清中低水平的1，25 (OH)2D3與乳腺癌的進(jìn)展相關(guān)，這可能是通過關(guān)鍵分子維生素D受體(VDR)的介導(dǎo)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或經(jīng)由RB－E2F通路來抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖或轉(zhuǎn)移來實(shí)現(xiàn)的［5］。此外，免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示VDR蛋白不僅在70%～90%的乳腺癌組織中有表達(dá)，并且在不同癌細(xì)胞系中表達(dá)水平不一樣［6］。鑒于VDR結(jié)構(gòu)和(或)功能，以及血循環(huán)中維生素D的水平可潛在地受VDR基因多態(tài)性的影響，故VDR的基因多態(tài)性與乳腺癌易感性的關(guān)系備受關(guān)注。

rs1544410(BsmI)、rs7975232(ApaI)和rs731236 (TaqI)位點(diǎn)是VDR基因最常見的SNP位點(diǎn)，均位于VDR基因3'末端，該區(qū)域的基因變異呈現(xiàn)出連鎖不平衡現(xiàn)象，并且潛在地與VDR mRNA的表達(dá)水平相關(guān)［7］。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為rs1544410位點(diǎn)A等位基因的存在能降低乳腺癌的發(fā)病或轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。在英國(guó)和美國(guó)婦女中，攜帶有rs1544410 GG基因型分別會(huì)增加1．92和1．53倍發(fā)生乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)［8，9］。若血清1，25 (OH)2D3水平低于50nmol/L同時(shí)攜帶rs1544410 GG基因型的女性發(fā)生乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)則會(huì)增加到6.82倍［10］。對(duì)于rs731236位點(diǎn)，Lundin等［11］認(rèn)為CC基因型患者的病死率(22%)遠(yuǎn)低于TT型(41%)或CT型(44%)的病人，且TT型病人的癌腫發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)比攜帶C等位基因的患者明顯增加。本研究以浙江地區(qū)漢族婦女作為研究對(duì)象，未發(fā)現(xiàn)該兩個(gè)基因型與乳腺癌相關(guān)，但發(fā)現(xiàn)rs7975232位點(diǎn)與乳腺癌相關(guān)，攜帶有TT基因型的人群較GG基因型患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)低。我們的研究與來自于澳大利亞的研究結(jié)果相符，后者揭示G等位基因或GG基因型可以增加乳腺癌的患病率［12］。此外，單體型研究也發(fā)現(xiàn)GTT具有較低的患乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)，而單體型AGT則發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)較高。

此外，研究發(fā)現(xiàn)血漿中1，25(OH)2D3含量與基因型分布頻率差異并無直接相關(guān)，提示基因型差異可能通過其他某種途徑實(shí)現(xiàn)其對(duì)乳腺癌細(xì)胞的影響。然而本研究還存在一些不足，如研究還缺乏評(píng)價(jià)女性患者的絕經(jīng)狀態(tài)、ER和PR表達(dá)情況，另外，樣本和分析的位點(diǎn)數(shù)量不足，未對(duì)多個(gè)人群進(jìn)行橫向比較研究等，相信做好這些方面才可得到更準(zhǔn)確的結(jié)論。

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(收稿:2012－01－05)

(修回:2012－02－17)

Relationship between Genotypes and Halpotypes of Vitamin D Receptor Gene and Breast Cancer Risk．

ObjectiveTo investigate the relationship between genotypes and halpotypes in the vitamin D receptor(VDR)gene and breast cancer risk．MethodsSamples were collected from 146 breast cancer patients and 320 non－cancer female controls．The genotypes were detected by PCR－RFLP and confirmed by sequencing．The levels of plasma 1，25(OH)2D3were measured by ELISA．The association between genotype and allelic frequencies with protein levels were calculated and analyzed by SPSS 13．0 software．ResultsOf three SNPs，only rs7975232 TT was shown to associate with 0．46－fold risk of breast cancer．No association of VDR genotypes and the levels of plasma 1，25(OH)2D3were found．Additionally，the frequency of haplotype AGT was 3．8%in cases，significantly higher than that in controls(0．8%，P=0．002)．However，the frequency of haplotype GTT in cases were significantly lower than that in controls (19．8%vs 26．7%，P=0．018)．ConclusionVDR gene polymorphisms are related to breast cancer risk．Individuals with haplotype GTT show lower risk，but the individuals with halpotype AGT have higher risk．

Vitamin D receptor;Genotype;Haplotype;Breast cancer

Huang Youze，Lu Hong，Bai Yongheng，et al．The 8th People Hospital of Wenzhou City，Zhejiang 325000，China

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，但其發(fā)病的確切分子機(jī)制到目前為止尚未清楚。近年來發(fā)現(xiàn)，維生素D受體(vitamin D receptor，VDR)可能在乳腺癌的病因?qū)W中起著重要的作用［1，2］。本研究擬通過分析VDR基因3'端UTR區(qū)域rs1544410、rs7975232和rs731236點(diǎn)的基因型、等位基因和單體型，并檢測(cè)血漿中1，25(OH)2D3含量，旨在從遺傳功能學(xué)角度探討其與乳腺癌遺傳易感性的關(guān)系，從而有助于了解疾病的發(fā)病機(jī)制。

溫州市鹿城區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目(S10106)

325000溫州市第八人民醫(yī)院檢驗(yàn)科(黃友澤、陳以勒、曾云祥);溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)診斷中心(陸紅);外科實(shí)驗(yàn)室(白永恒、潘貽飛)

白永恒，電子信箱:greatsailor@163．com